口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗(OHM/02株+AKT-III株)纯度、免疫持续期、攻毒保护的研究

陈 婷，张起伟，辛俊宝，代创科，黎倩倩，倪春霞

(杨凌金海生物技术有限公司，陕西 杨凌 712100)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的多发于猪、牛、羊等偶蹄目动物的一种急性、烈性、热性、高度接触性传染的疾病。世界动物卫生组织已将其列为A类传染病之首，对畜牧业发展和人类食品卫生安全造成巨大威胁。注射口蹄疫疫苗是目前预防猪、牛、羊感染口蹄疫最便捷、最有效的手段。绝大多数地区、国家仍采取以免疫灭活疫苗为主的防控措施。

口蹄疫灭活疫苗是一种以细胞培养技术为载体制备口蹄疫病毒液，并将病毒液彻底灭活，获得口蹄疫抗原的疫苗制备方式。因此，灭活疫苗的安全性、免疫效果的稳定性、对动物的保护率是评定口蹄疫疫苗质量的重要指标。

为了解口蹄疫灭活疫苗免疫动物后的免疫效果、免疫安全性及免疫持续期，准确掌握口蹄疫灭活疫苗对牛的保护情况，本文选用口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗(OHM/02株+AKT-III株)免疫接种6～9月龄口蹄疫阴性牛，监测免疫后的NSP抗体水平，评估疫苗免疫的安全性及纯度。同时，持续测定免疫后动物的口蹄疫O型、A型抗体水平，评估疫苗的免疫效果及抗体水平持续期，并对免疫牛进行攻毒保护，评估疫苗免疫的可靠性。

1 材料和方法

1.1 疫苗种类

口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗(OHM/02株+AKT-III株)，厂家：杨凌金海生物技术有限公司。

1.2 实验动物

6～9月龄口蹄疫抗体阴性牛(ELISA)，共16头，其中12头用于免疫，4头作为对照。

1.3 试剂盒选择

口蹄疫O型、A型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒购于兰州兽研科技有限公司(原中国农业科学院兰州兽医研究所)，口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体检测试剂盒购于北京金诺百泰生物技术有限公司。

1.4 动物免疫接种

随机抽取口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗(OHM/02株+AKT-III株)三瓶，测定疫苗146s抗原含量、总蛋白含量及内毒素含量，混匀后用于免疫。对免疫组牛进行两次免疫，免疫牛舌背面皮内各分20点注射灭活疫苗，每点注射0.1 mL，共2 mL。一次免疫28 d后对免疫牛进行二次免疫。方法同一次免疫。免疫时间从第一次免疫后开始计算。

1.5 疫苗免疫纯度及安全性测定

在免疫期间持续观察、记录免疫牛的身体状况，并在免疫不同阶段(免疫后5 d、28 d、56 d)对牛采血，使用口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体检测试剂盒对血清进行口蹄疫非结构蛋白(NSPs)抗体测定。

1.6 疫苗免疫持续期抗体水平测定

使用口蹄疫O型、A型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒(免疫后5 d、28 d、56 d、85 d、110 d)牛血清进行口蹄疫O型、A型抗体水平测定。

1.7 攻毒保护测试

攻毒测试在本单位动物房生物安全三级防护区进行，选用OHM/02株、A/XJNC/2010株强毒对免疫后110 d免疫牛及对照牛做攻毒测试。免疫组牛分两组，分别于舌上皮下两侧分两点分别注射强毒OHM/02株(10ID50/0.2 mL)、A/XJNC/2010株(10ID50/0.2 mL)，连续观察10 d，计算疫苗对免疫牛的保护率。

2 结 果

2.1 疫苗纯度及安全性检测结果

免疫用疫苗质量测定如表1，第一次免疫用疫苗146s抗原平均含量为21.7 μg/头份，总蛋白均值138 μg/mL, 内毒素含量含量均小于0.25 EU/头份，二次免疫用疫苗146s抗原平均含量为21.9 μg/头份，总蛋白均值129 μg/mL, 内毒素含量含量均小于0.25 EU/头份，符合注射要求。免疫后持续观察免疫牛、对照牛牛舌、口腔粘膜、乳房和蹄部等可能产生口蹄疫症状的部位，在整个免疫阶段，免疫牛、对照牛均未出现口蹄疫症状。在免疫后5 d、28 d、56 d对牛血清进行口蹄疫非结构蛋白(NSPs)ELISA测定(表2)，免疫牛、对照牛NSPs抗体均为阴性。

表1 免疫用疫苗146s抗原含量、总蛋白含量、内毒素含量检测结果Table 1 Results of 146s antigen content, total protein and endotoxin content of immune vaccine

表2 免疫组免疫后NSPs抗体水平检测结果Table 2 The levels of non-structural protein (NSPs) antibodies after the immunization group were immunized

2.2 口蹄疫疫苗免疫持续期抗体水平检测结果

免疫前、免疫持续期牛血清口蹄疫O型、A型抗体水平测定结果如图1所示，在免疫后28 d口蹄疫O型、A型抗体水平均出现明显上升。口蹄疫O型抗体在免疫后28 d抗体水平达到最大值，28 d免疫组牛二次免疫后，口蹄疫O型抗体水平持续保持在较高水平。口蹄疫A型抗体在免疫后56 d抗体水平达到最大值，并在后期保持较高水平。口蹄疫O型抗体效价在免疫28 d后均显著高于A型抗体效价，并在免疫后28 d呈极显著差异。根据试剂盒判定标准，牛抗体效价大于等于1∶128，动物99%以上保护效力，在免疫后28 d，免疫组O型平均抗体水平高于99%以上保护线，并在整个免疫持期维持在较高水平。免疫组A型平均抗体水平在免疫后28 d接近99%以上保护线，在免疫后56 d高于99%以上保护线，并在免疫持续后期维持在较高水平。

图1 疫苗免疫持续期免疫组口蹄疫持续性O型、A型抗体效价*差异显著(P<0.05)，**差异极显著，(P<0.01)。Fig. 1 The titer of type O and type A antibodies of FMD in the immunization group during the maintenance phase of immunized group*means significant difference (P<0.05), **means highly significant difference(P<0.01).

2.3 攻毒保护测试结果

在免疫后110 d对免疫组及对照组牛攻毒保护测试，结果见表3，免疫组牛经O型OHM/02株口蹄疫强毒、A型A/XJNC/2010株强毒攻击后，均未产生口蹄疫典型临床症状。对免疫组牛保护率为100%。对照组牛经攻毒后，全部产生口蹄疫病症。

表3 免疫组在免疫110 d后牛O型、A型毒株的攻毒保护结果Table 3 The results of the protective effect of bovine type O and type A viruses after 110 days of immunization

3 讨 论

目前，国内外绝大多数地区对口蹄疫的防御措施仍以接种口蹄疫灭活疫苗为主，生产的口蹄疫疫苗应尽量减少疫苗质量原因引起的动物不良反应。试验结果显示，免疫组牛经口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗(OHM/02株+AKT-III株)免疫接种，在整个免疫阶段，免疫牛均未出现口蹄疫典型症状，无不良反应。

NSPs抗体是区分感染口蹄疫病毒动物与口蹄疫疫苗免疫动物的重要指标。尽管国内口蹄疫灭活制备工艺有飞跃性提高，但口蹄疫灭活疫苗仍存在含痕迹量NSPs的风险。这将严重影响对口蹄疫感染动物与免疫动物的判断，同时也影响口蹄疫疫苗的免疫效果。动物经口蹄疫疫苗免疫后，至少检测两次动物血清NSPs抗体，用以评价疫苗的纯度。本研究免疫牛NSPs抗体水平均为阴性，说明口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗(OHM/02株+AKT-III株)疫苗纯度高。

灭活疫苗具良好的免疫原性，高质量的口蹄疫疫苗免疫动物后可引起动物机体产生高浓度的特异性抗体，对免疫动物产生良好的免疫效果。本试验口蹄疫疫苗免疫持续期O型、A型抗体水平在免疫后28天均明显升高且逐步达99%以上保护效力，并在整个持续期保持较高抗体水平，口蹄疫疫苗免疫持续期内O型抗体水平高于A型抗体。这表明免疫组牛注射口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗(OHM/02株+AKT-III株)可诱导机体产生较高水平特异性抗体，且O型抗体水平更高。

攻毒保护试验是衡量口蹄疫疫苗免疫效果的重要指标。本试验中免疫组牛均未产生口蹄疫典型临床症状。结果表明，口蹄疫疫苗对免疫牛具有良好的保护作用。口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗(OHM/02株+AKT-III株)对牛具有良好的免疫效果。

综上所述，口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗(OHM/02株+AKT-III株)免疫的安全性及纯度良好。免疫持续期内可诱导免疫牛产生较高浓度特异性抗体，对口蹄疫病毒防御可靠性强，对免疫牛产生攻毒保护，免疫效果良好。