喷施除草剂对橘园土壤及果实品质的影响

沈玥，宋放，陈爽，李红飞，郭慧芸，潘志勇

1.华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉 430070；2.湖北省农业科学院果树茶叶研究所，武汉430064

杂草防治是橘园土壤管理的重要环节。尽管人工除草是最环保的举措，但由于农村劳动力短缺、人工成本高、除草效率低等，生产上普遍通过喷施除草剂来除草［1］。然而除草剂是一类有毒性的有机污染物，且所喷施的除草剂仅有一小部分能被植物吸收，绝大部分会流失并进入土壤，造成环境污染，同时威胁人畜安全［2］。生产上常用的除草剂有草甘膦及其衍生物、草铵膦以及精喹禾灵等。草甘膦对1年生及多年生禾本科杂草均有防除作用［3］；草铵膦是一种广谱触杀型有机磷除草剂，其毒性低、活性高、易降解，具有较强的环境相容性和植物广谱性［4］；精喹禾灵是一种主要用于大豆、油菜等作物的除草剂，目前也有部分葡萄园、柑橘园用于防治禾本科杂草［5］。

施用除草剂会影响柑橘等作物的正常生长和抗性。张岳［6］发现施用20%和30%的草甘膦水剂均会影响柑橘毛细根生长，导致柑橘树易被病原真菌侵染，从而使受药柑橘树更易感砂皮病；马小焕等［7］研究发现叶片喷施草甘膦对柑橘嫩梢有毒副作用，造成嫩梢嫩叶发黄甚至枯死，易形成丛生状芽和扭曲针形叶，导致幼果脱落；钟德志［8］将80倍10%草甘膦水剂液误喷在温州蜜柑上导致全树叶片脱落，且次年春天抽生的新梢短小、新叶成扭曲针状叶。施用除草剂也会影响土壤的理化性质，如导致土壤含水量下降和容重上升［9］、土壤有机质含量降低和土壤肥力下降［10］、土壤碱解氮等氮素下降或流失［11］。

土壤微生物对土壤腐殖质形成、有机质分解、土壤肥力保持以及作物生长发育具有重要作用［12］，其中土壤细菌、放线菌和真菌等微生物的数量与土壤养分状况密切相关［13］。研究发现施用除草剂会影响土壤微生物的丰度及多样性。邹亚丽等［14］于苹果园分别施用2种盐剂草甘膦，发现土壤真菌数量显著增加，而放线菌数量显著降低，细菌总量则无明显变化。倪福乐等［15］发现200～500倍不同浓度的草甘膦均能显著降低盆栽砂糖橘的根际真菌、放线菌、细菌的丰度。Druille 等［16］发现施用草甘膦导致包括伯克霍尔德菌属、假单胞菌属、丛枝菌根真菌和固氮根瘤菌属等植物有益微生物的丰度及多样性下降。姚斌等［17］发现，土壤微生物的数量及多样性均随喷施阿特拉津除草剂浓度及次数的增加而降低。但也有研究表明草甘膦处理对板栗根际土壤细菌群落多样性无显著影响［18］。

综上，施用除草剂会对土壤理化性质和作物生长发育带来较大负面影响，但在柑橘等果树作物上尚缺乏系统研究，尤其是关于除草剂对土壤微生物的影响还不清晰甚至有一定争议。因此，本研究以柑橘主栽品种温州蜜柑为材料，调查了田间条件下草甘膦异丙胺盐、草铵膦及精喹禾灵等3种常用除草剂的施用对土壤理化性质、土壤微生物及果实品质的影响，旨在为客观认识除草剂的作用、科学施用除草剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

选择华中农业大学柑橘试验基地温州蜜柑（国庆1 号Citrus unshiuMarc.cv.Guoqing No.1）结果树16株，树龄20 a，树体长势一致。该地块5 a内未施用供试除草剂。将此16株供试植株随机分为对照组及T1、T2、T3 共4 组，每组4 棵树。对照组采用人工刈割除草，处理组分别喷施3 种不同的除草剂。T1 为喷施0.5%草甘膦异丙胺盐（商品名：农达；农药登记证号：PD73-88）、T2 为喷施0.5%草铵膦（商品名：焚草；农药登记证号：PD20171993）、T3为喷施0.2%精喹禾灵（商品名：精禾草克；农药登记证号：PD20095860）。遵循组间统一施药原则，自2021 年4月1 日首次施药后，每当杂草生长至出现第3 片真叶或生长长度近3 cm 时喷施除草剂［19］，直至果实成熟。本试验分别在4月1日、5月12日、5月29日、6月16 日、7 月3 日、8 月1 日、8 月22 日、9 月29 日、10 月4日、11月13日共施药10次。

1.2 土壤理化指标检测

于喷施除草剂后0 d、盛花期、坐果期、转色期4个时期随机选择每棵植株的4个不同方位，取表层土（0～10 cm）土样并将来自同一植株的土样混合作为1 个样品［20］，利用电位法测土壤pH［21］，经典环刀法测土壤容重［21］。

果实成熟后沿树体滴水线取表层土壤（0～10 cm）。利用苯酚钠法测土壤脲酶活性，3，5-二硝基水杨酸法测土壤蔗糖酶活性，硝基酚比色法测土壤酸性和碱性磷酸酶活性［23］，重铬酸钾容量法-外加热法测土壤有机质含量，碱解-扩散法测土壤碱解氮含量，碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测土壤速效磷含量，乙酸铵交换-火焰光度法测土壤速效钾含量［24］。

1.3 土壤微生物检测

分别取每棵柑橘树滴水线附近0～10 cm 表层土壤或根际土壤，将同一棵树4个不同方位的采样点的土样均匀混合为1个样品。使用OMEGA 土壤DNA试剂盒（M5635-02）提取土壤总基因组DNA（Omega Bio-Tek，Norcross，GA，USA），使用NanoDrop NC2000 分光光度计测量提取的土壤DNA 的质量和浓度（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）。利用正向引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGCAGCA-3′）和反向引物806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）PCR 扩增细菌16S rRNA 基因的V3-V4 区域，送上海派森诺公司使用Illlumina NovaSeq 测序。使用QIIME2 和R（3.2.0）进行序列数据分析。随后利用QIIME2 中的ASV 表计算ASV 水平的α 多样性指数（Shannon 多样性指数）以调查群落物种丰富度和多样性等，并可视化为箱线图；基于Bray-Curtis 度量和UniFrac 距离度量进行β多样性分析，以调查样本中微生物群落的结构变化，并通过主坐标分析（PCoA）进行可视化。

1.4 果实产量和品质检测

果实达到可食用品质后（11 月25 日）采样，每棵树在树冠外围随机采集5个果实，施药和对照每个处理均为4 棵树，每个处理各20 个果实。利用电子天平称取单果质量；利用*cm-5 色彩色差仪（美能达，日本）测定果皮的亮度值（L*）、红绿值（a*）、黄蓝值（b*），并根据色差综合指标色差值的正负（CCI=1000×a*/（L*×b*））评价转色情况，CCI 为负值代表蓝绿色程度高，为正值则表示果皮偏向红色［25］；每个处理的20个果实随机分为4份，每份5个果实均取一半果肉榨汁并混匀过滤，将滤液稀释50 倍后滴于手持式数量测糖仪（0-53% PAⅬ-1，日本Atago 公司）监测点并直接读出果肉的可溶性固形物含量和可滴定酸含量［26］；用草酸-二氯酚靛酚滴定法［27］测定维生素C含量。

1.5 数据分析

运用Excel 2019 和SPSS 进行数据统计及分析，采用Duncun’s多重比较法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 喷施不同除草剂对橘园土壤理化性质的影响

分别检测喷施除草剂0 d、盛花期、坐果期、转色期的橘园的土壤pH 及容重（图1）。结果表明：喷施草甘膦异丙胺盐（T1）导致树体滴水线附近表层土壤pH显著降低，而喷施草铵膦（T2）或精喹禾灵（T3）对土壤pH 无显著影响（图1 A）；经3 种除草剂分别处理后表层土的容重总体均呈上升趋势，其中T2和T3处理中坐果期的土壤容重显著增加，而T1 对土壤容重的影响不显著（图1B）。

喷施除草剂后柑橘果实成熟期的土壤酶活性检测结果（图2）显示：T1处理导致4种土壤酶活性显著上升；T2处理导致土壤酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和脲酶活性显著上升，而对蔗糖酶的活性无显著影响；T3处理显著提高了土壤碱性磷酸酶和脲酶活性，显著降低蔗糖酶活性，但对酸性磷酸酶活性的影响不显著。

检测结果（图3）显示，喷施3 种除草剂对土壤有机质、碱解氮、速效磷和速效钾含量均无显著影响。

2.2 喷施不同除草剂对橘园土壤及根际微生物的影响

用Shannon 指数表征土壤微生物的α 多样性（图4 A），结果显示：喷施3 种除草剂不同程度降低了土壤微生物的Shannon 指数（图4 A）但均未达到显著水平（P＞0.05）。该结果说明除草剂处理并未显著影响橘园土壤微生物的α 多样性。用PCoA（principal coordinates analysis）主坐标分析表征土壤微生物的β 多样性（图4 B），探究不同处理组间微生物的组成差异，发现4 个处理的样本聚集在一起，且各处理间距离远、无任何交叉，说明喷施除草剂的3个处理组与对照以及不同处理组间，其土壤微生物群落相似性很高，且3种除草剂对土壤微生物群落产生了明显的分离，使得其组成有显著差异。

进一步分析各样品组的微生物优势物种在门水平和属水平上的相对丰度差异，结果显示，除草剂处理组与对照组在门水平上相对丰度差异显著的微生物分别是：酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、蓝细菌门（Cyanobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和匿杆菌门（Ⅼatescibacteria）（表1）。其中T1 导致酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和匿杆菌门（Ⅼatescibacteria）相对丰度显著下降；T2 导致酸杆菌门（Acidobacteria）和匿杆菌门（Ⅼatescibacteria）相对丰度显著下降、蓝细菌门（Cyanobacteria）相对丰度显著上升；T3 导致酸杆菌门（Acidobacteria）相对丰度显著下降。除草剂处理组与对照组在属水平上相对丰度差异显著的微生物共有24个（表2），包括分枝杆菌属（Mycobacterium）、热酸菌属（Acidothermus）、游动放线菌属（Actinoplanes）、克洛氏菌属（Crossiella）、假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）等。

表1 柑橘土壤微生物相对丰度有显著差异的菌门Table 1 The relative abundance of soil microbial on phylum level has significant difference with CK in citrus orchard after spraying herbicides %

表2 柑橘土壤微生物相对丰度有显著差异的菌属Table 2 The relative abundance of soil microbial on genus level has significant difference with CK in citrus orchard after spraying herbicides%

本研究同时检测了喷施除草剂对橘园根际微生物多样性的影响（图5）。结果显示：与CK 相比，T1根际土壤微生物的Shannon 指数显著降低（图5 A），但T2、T3 与CK 均无显著差异。这说明T1 处理显著降低了橘园根际微生物的α 多样性，而T2、T3 对其无显著影响。基于PCoA 的根际微生物β 多样性分析表明，处理组与对照组间有交叉，处理组间也有交叉，说明T1、T2、T3 处理组与CK 组的根际微生物群落组成无差异（图5 B）。

2.3 喷施不同除草剂对柑橘产量及品质的影响

如图6 所示，与对照组相比，T1 和T3 组的单果质量分别降低了16.72%和28.8%，均呈极显著差异，而T2无显著差异（图6A）。施用除草剂对果实可食率（图6B）、亮度值（L*）（图6C）均无显著影响；且仅有T3 显著降低黄蓝值（b*），T1、T2 对黄蓝值无影响（图6E）。而果皮红绿值（a*）（图6D）和色差综合指标色差值（CCI）（图6F）在施用了除草剂后均有不同程度的降低，且T3 下降最多，说明施用除草剂导致果皮转色不同程度受阻。T1 和T3 处理均导致果实可溶性固形物含量显著降低（图6G），从对照的10.6%分别降低至9.7%和10.3%，而T2 与对照无显著差异；T1、T2 和T3 处理均显著提高了果实可滴定酸含量（图6H），分别由对照的0.89%提高至0.94%、0.96%和1.14%；施用不同除草剂使果实固酸比显著降低（图6I）。仅T3 处理显著降低了果实维生素C 含量（图6J），由31.37 mg/100 mⅬ下降至25.49 mg/100 mⅬ。

3 讨论

本研究发现喷施精喹禾灵和草铵膦导致土壤容重显著增加，而喷施草甘膦异丙胺盐对土壤容重的影响较小（图1）。由于土壤容重增加代表土壤团粒结合得更为紧密，透气性减弱［28］，这意味着喷施精喹禾灵和草铵膦这2 种除草剂可能会导致土壤板结。喷施草铵膦和精喹禾灵对土壤pH 无明显影响，但喷施草甘膦降低了橘园土壤pH（图1），导致土壤酸化，这与前人研究结果基本一致［29］。这可能是因为，一方面草甘膦异丙胺盐本身呈酸性，其水溶液pH 值为1.0～1.9，按照田间指导用量稀释200倍后pH 值仍为4.34；另一方面，草甘膦异丙胺盐含有3 个可电离的活泼氢，在土壤中极易形成钠盐、铵盐或异丙胺盐，水解后其pH 值可进一步降低［30］，从而导致土壤酸化。前人研究发现施用阿特拉津、二氯喹啉酸等除草剂会导致土壤养分供应能力下降，主要表现为有机质、速效磷、碱解氮和速效钾含量的下降［31］，但本研究发现喷施3 种除草剂对以上土壤养分均无显著影响（图3），这可能与本研究所用的除草剂类型或试验的土壤性质与前人不同有关。本研究发现喷施3种除草剂对土壤酶活性有不同程度的激活作用，这与前人的研究结果相一致［32］；但也有研究发现氯嘧磺隆等除草剂会抑制土壤脲酶、磷酸酶等土壤酶的活性［33］；这说明除草剂对土壤酶活的影响比较复杂，可能受到多种因素，诸如作物和土壤类型、施药浓度、气候的影响［34］。

前人研究表明，施用除草剂会导致土壤微生物丰度及多样性普遍降低［35］。本研究发现喷施3 种除草剂对橘园土壤微生物的α 多样性无明显影响（图4），这意味着土壤本身可能具有缓冲效应，能使土壤微生物的总体丰度在一段时间内不发生显著改变［36］。但施用除草剂显著改变了土壤微生物的组成，导致酸杆菌门（Acidobacteria）等菌门的相对丰度显著下降，蓝细菌门（Cyanobacteria）的相对丰度显著上升（表1）。该结果意味着除草剂可能抑制乃至杀死了某些土壤微生物，而另一些耐除草剂强的土壤微生物有所增长。例如，喷施除草剂导致酸杆菌（Acidobacteria）、放线菌（Actinobacteria）等植物生长有益菌和厚壁菌门（Firmicutes）等生防菌的相对丰度显著下降（表1），这可能会影响土壤碳、氮等养分的释放［37］以及植物的正常生长发育和抗逆性等［38］。有意思的是，与土壤微生物相反，根际微生物的α 多样性即总丰度普遍下降，而群落组成没有变化（图5）。这可能是因为植物根系倾向于募集对其有益的土壤微生物［35］，因此，根际微生物的组成相对稳定，但是由于土壤有益微生物可能受到了除草剂的抑制，使得其总丰度下降。

本研究中喷施除草剂显著降低了柑橘单果质量，导致果实转色延迟、酸度增加和维生素C 含量降低（图6）。这与前人报道的施用除草剂减少了玉米的产量［39］，降低了葡萄的可溶性固形物、维生素C 和花青苷含量［40］的结果一致。这可能是因为一方面除草剂影响了土壤理化性质及微生物，从而一定程度上限制了植物根系对土壤养分的吸收［41］；另一方面，除草剂可阻断植物光合作用的电子传递而抑制光合作用［42］，进而影响植株生长和果实产量及品质的形成［43］。

综上，在土壤肥力适中的温州蜜柑园中多次喷施草甘膦异丙胺盐等除草剂影响了橘园土壤容重、pH 值及酶活等土壤理化性质，导致土壤有益微生物的多样性与丰度下降，最终导致果实产量和品质的下降。本研究主要调查了温州蜜柑在华中地区黄棕壤背景下除草剂对土壤理化性质和果实品质的影响，对橘园除草剂的科学施用具有一定的指导意义，但除草剂在不同柑橘品种和不同土壤背景下对橘园土壤和果实品质的影响仍需进一步探讨。