半夏泻心汤治疗复发性口腔溃疡的Meta分析及分子机制探讨*

韩春雯，张丽娜，汪梅姣，张 祎，高 燕，李海昌，谢志军

（1.漳州卫生职业学院，福建 漳州 363000；2.浙江中医药大学基础医学院，浙江 杭州 310053）

复发性口腔溃疡（recurrent oral ulceration，ROU）是一种常见的、复发性疾病，表现为单个或多发性、圆形至卵圆形边缘清晰的红斑晕圈[1]，属于中医“口疮”、“口糜”和“口疡”等范畴。《黄帝内经》首次提出“口疮”、“口糜”的病名。复发性口腔溃疡的特点是易复发，易迁延。历代研究认为该病与心脾相关，多属虚实夹杂，寒热交错之证。半夏泻心汤方首见于《伤寒论》，其组方为：半夏半升（洗），黄芩、干姜、人参、炙甘草各三两，黄连一两，大枣十二枚。此方药物组成特点是寒温药并用，辛开苦降，攻补兼施，属于中医和解之剂。本为治疗寒热错杂痞证的方剂，因其辛开苦降以顺升降，寒温并用以和阴阳，补泻兼施以调虚实的特性，所治病证几乎包括了所有的消化系统疾病，不仅可以解除胃肠道不适，又可以治疗寒热错杂、虚实并见的口腔溃疡。

本研究以半夏泻心汤为基础方治疗ROU的临床对照实验文献进行系统评价与Meta分析，筛选并整理研究数据及结果，对纳入文献进行系统评价与Meta分析，并运用网络药理学方法对此方治疗复发性口腔溃疡的生物学机制进行初步探讨。

1 资料与方法

1.1 系统评价与Meta分析研究方法

1.1.1 文献纳入及排除标准 纳入标准：以半夏泻心汤为基础方治疗ROU的临床对照试验，有明确的诊断标准；纳入任何年龄、性别、病程、干预时机和疗程的文献。干预方法：治疗组以半夏泻心汤为基础方治疗，对照组以常规西药或中成药治疗。结局指标：临床总有效率、口腔溃疡复发情况。排除标准：本文排除综述类文献、动物实验类文献、会议文章等。

1.1.2 检索策略 检索中国知网（CNKI）、万方数据库（Wan-Fang Data）、中国中医药数据库（TCMDB）、维普资讯中文期刊服务平台（VIP）、PubMed数据库，中文检索词包括：半夏泻心汤、复发性口腔溃疡、复发性口疮，英文检索词包括Banxiaxiexintang、Banxiexiexin decotion、BXXXT、recurrent oral ulcer、ROU。检索时限为建库至2021年12月30日。

1.1.3 文献筛选及数据提取 由两名研究人员独立根据中英文检索词分别检索，并根据纳入标准和排除标准筛选出符合条件的相关文献。阅读全文后提取作者姓名、文章发表的年份、样本量、病例相关的信息、治疗组和对照组分别采取的治疗措施、结局指标等相关信息。

1.1.4 文献质量的评价 参考Cochrane评价条目[2]，评价的主要内容包括：随机分配方法、是否采用分配隐藏、是否使用盲法、结局指标是否具有完整性、有无选择性结局报告等相关内容。

1.1.5 统计方法 采用Review Manager 5.3软件进行Meta分析。使用I2指数评价研究的异质性，I2＞50%，提示纳入文献异质性较高。二分类变量采用比值比（odds ratio，OR）为试验效应指标，合并统计量检验采用可信区间法（95%CI）表示。

1.2 网络药理学研究方法

1.2.1 半夏泻心汤化合物与标靶的获取 使用中药系统药理学数据库和分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）分别查找半夏、黄连、黄芩、干姜、人参、甘草、大枣，获取相应的化合物。以口服利用度（oral bio-availability，OB）≥30%，类药性（drug likeness，DL）≥0.18为条件进行化合物的筛选，并运用TCMSP查找筛选化合物对应的靶标信息，并获取靶标对应的基因Symbol。ROU 疾病基因获取：以“recurrent oral ulcer”为 关 键 词 从 GeneCards 数 据 库（https：//www.genecards.org/）和 OMIM 数据库（https：//omim.org/）获取ROU疾病的基因。

1.2.2 机制分析 用R软件获取半夏泻心汤与ROU疾病交集基因。运用Cytoscape软件来绘制“疾病-中药-交集靶标（基因）”的网络图。将所得到的交集基因输入 STRING（http：//string-db.org）数据分析平台并进行PPI分析，数据分析模式设定为“Multiple proteins”，物种为“Homo sapiens”。对数据进行预读后并将置信度设置为≥0.90，同时隐藏孤立蛋白，导出TVS文件。最后使用Cytoscape 3.9.0软件进一步绘制PPI图，并获得核心蛋白。使用Cytoscape 3.9.0软件中的ClueGo插件进行GO富集及KEGG通路分析，选取前10个结果进行绘图可视化。

2 结果

2.1 系统评价与Meta分析研究结果

2.1.1 文献检索结果 通过检索获得245篇文献。阅读文题和摘要及相关全文后，剔除与主题不符的文献221篇；初步获得文献24篇，仔细阅读全文并剔除重复文献11篇，最终纳入Meta分析的文献共13篇。检索流程及结果见图1。

图1 文献检索流程及结果

2.1.2 纳入文献的基本特征 共纳入13个研究，共1 165例患者，其中治疗组642例，对照组523例，其中有13篇文献报告了临床总有效率[3-15]，3篇文献报告了 3 个月复发情况[5，12，15]，3 篇文献报告了 6 个月复发情况[5，13，15]。纳入研究的基本特征见表 1。

表1 纳入研究的基本特征

2.1.3 纳入文献质量评价 纳入的13个研究，其中9篇[4-8，11-14]提及“随机”字样但未提及具体随机方法，1 篇对照、双盲、随机实验[10]，1 篇“抽签法”[15]，1 篇“按不同治疗方法分组”[9]，1篇未说明分组方法[3]。所有纳入的文献结局资料都完整，无选择性结局报告。所纳入的研究无法判断是否有其他偏倚来源。具体文献质量评价结果见图2。

图2 纳入文献质量评价图

2.1.4 结局指标分析 总有效率比较：纳入的13个研究均有总有效率这一结局指标，运用Meta分析比较治疗组与对照组之间总有效率，结果显示总有效率OR=6.62，95%CI（4.40，9.96），P＜0.000 01，表明以半夏泻心汤为基础方治疗ROU总有效率优于对照组。结果见图3。

图3 总有效率比较森林图

复发率比较：运用Meta分析比较治疗组和对照组之间的复发率，结果显示复发率OR=0.26，95%CI（0.15，0.47），P＜0.000 01。亚组分析显示，3个月复发率 OR=0.25，95%CI（0.10，0.63），P=0.003；6 个月复发率 OR=0.27，95%CI（0.13，0.59），P=0.000 9。结果表明以半夏泻心汤为基础方治疗ROU 3个月、6个月复发率都小于对照组。结果见图4。

图4 复发率比较森林图

发表偏倚：对半夏泻心汤为基础方治疗ROU患者的总有效率进行偏倚分析。结果显示，临床总有效率的漏斗图显示不完全对称性，考虑存在一定的发表偏倚。见图5。

图5 临床总有效率漏斗图

2.2 网络药理学研究结果

2.2.1 半夏泻心汤与疾病交集靶点筛选 以OB≥30%、DL≥0.18为筛选条件，获得各个中药靶点。从GeneCards数据库共获得ROU疾病基因3 948种，OMIM数据库获得ROU疾病基因32种，除去重复总3 757种。各中药靶点组合去重后得到半夏泻心汤靶点，与ROU疾病靶点取交集，共得到201个重叠靶点，见图6。用Cytoscape 3.9.0软件构建疾病-中药-交集靶点（基因）PPI网络图，见图7。

图6 “疾病基因-中药靶标基因”韦恩图

图7 疾病-中药交集靶点（基因）网络图

2.2.2 PPI蛋白互作网络构建 将所得到的交集基因输入STRING数据分析平台，并进行蛋白互作分析，再运用Cytoscape 3.9.0软件绘制PPI图，见图8。网络图中的节点代表着每个蛋白，边代表连接的2个蛋白具有相互作用的关系，按照度值（degree）、度中心性（degree centrality）的多少，得到互作关系排名在前5 的蛋白，分别是 JUN、STAT3、MAPK3、AKT1、RELA。

图8 PPI网络图

2.2.3 GO富集分析结果 对201个中药标靶-疾病交集基因进行GO分析，通过GO富集分析后获得符合筛选标准的条目共有631条，其中分子功能（molecular function，MF）有 10条、生物过程（biological process，BP）有 610条、细胞组分（cellular component，CC）有11条，按照所富集的基因数进行排序，并取基因数排列在前10的基因功能进行可视化，可见图中条形的高度代表着相应条目所富集的基因数量，见图9。GO结果显示，半夏泻心汤对凋亡过程、细胞内信号转导、蛋白质磷酸化、细胞迁移、程序性细胞死亡等生物过程，核激素受体结合、类固醇激素受体结合、脂肪酸结合蛋白、雄激素受体结合、CXCR趋化因子受体结合等分子功能均有广泛调节作用。

图9 GO富集分析结果

2.2.4 KEGG富集结果 对201个中药标靶-疾病交集基因进行KEGG分析，筛选后共获得相关信号通路158个，并按照所富集的基因数进行降序排列，取基因数排列在前10的进行可视化，见图10。KEGG分析结果表明，半夏泻心汤治疗ROU涉及的信号通路主要有癌症通路、感染相关通路、AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路等。

图10 KEGG通路富集结果

3 讨论

中医古籍中没有复发性口腔溃疡的记载，根据其临床特征，多归属于中医学“口疮”、“口疳”范畴。根据中医脾主运化，开窍于口的理论，过食辛辣肥厚之品、或劳倦内伤、或久病伤脾，均可导致脾阳受损，脾虚湿困，虚实夹杂，水湿内停，上渍口舌，发生口疮；湿浊蕴久化热，或夹心肝之火，致中焦寒热错杂，湿热上蒸，灼伤口舌，终成溃疡[16]。

ROU是最常见的口腔黏膜溃疡类疾病，一般表现为反复发作的溃疡，具有“红、黄、凹、痛”等特征，即在溃疡的表面覆盖有黄色的假膜、周围可见红晕带、中央呈现凹陷、并伴有明显的疼痛感。发作周期长短不一，可分为发作期、愈合期、间歇期，且具有不治自愈的自限性。ROU在任何年龄、性别都可罹患，不同程度地影响患者的生存质量。现代医学对ROU的研究颇多，但发病机制至今仍未明确，可能是多因素作用的结果，如免疫系统、遗传、内分泌、心理因素等。西医临床上，主要通过局部运用糖皮质激素结合维生素B进行治疗，但治疗效果欠佳[17]。

《伤寒论》中半夏泻心汤是治疗寒热错杂的经典方剂，方中以辛苦性温之半夏、辛热之干姜开结散寒，黄芩性味苦寒、黄连清热燥湿，并佐以性味甘温的人参、甘草、大枣以益气补虚。在临床实践中，运用半夏泻心汤加减治疗寒热错杂型ROU，效果明显。

本研究发现以半夏泻心汤为基础方治疗ROU具有效率高、复发率低的特点。为了研究其治疗ROU的作用机制，我们运用网络药理学对半夏泻心汤作用的靶基因和ROU疾病的基因进行GO和KEGG信号通路分析，GO分析结果表明，半夏泻心汤对细胞凋亡过程、细胞内信号转导、蛋白质磷酸化、细胞迁移、程序性细胞死亡等生物过程，以及核激素受体结合、类固醇激素受体结合、脂肪酸结合蛋白、雄激素受体结合、CXCR趋化因子受体结合等分子功能均有广泛的调节作用。

KEGG分析结果显示，半夏泻心汤治疗ROU涉及的信号通路主要有癌症通路、感染相关通路、AGERAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路等。基于网络药理学分析研究结果，可进一步开展多靶点、多通路的药理学验证，为深入阐明半夏泻心汤的作用机制提供新思路。

但是本次研究仍有一定的局限性：Meta分析中纳入文献质量不高，文献只提及随机实验，而未提及随机实验的具体方法，只有一篇文献使用盲法，所有文献均未进行分配隐藏；纳入的各个研究之间的用药及疗程等方面存在一定差异，这可能是导致偏倚发生的原因。网络药理学为研究中医药的复杂作用机制开辟了一条客观的道路，但是其存在着有效化合物及作用靶点数量有限、数据库存在偏倚等局限，且相关作用机制的研究还需更多的实验数据支撑。