饲料中添加雨生红球藻对尖吻鲈生长性能、抗氧化能力及免疫状态的影响

虞 为 ，陈雪晴，杨育凯 ，张燕娃 ，黄小林 ，黄 忠 ，李 涛 ，马振华 ，吴洽儿，于 刚，周传朋，林黑着

1. 中国水产科学研究院南海水产研究所/农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室/广东省渔业生态环境重点实验室，广东 广州 510300

2. 中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地，广东 深圳 518121

3. 中国水产科学研究院南海水产研究所热带水产研究开发中心，海南 三亚 572018

4. 广州大学 生命科学学院，广东 广州 510006

尖吻鲈 (Lates calcarifer) 又名金目鲈，属温水广盐性鱼类，主要分布于印度洋、太平洋西部热带和亚热带海域，其营养丰富、肉质鲜嫩、养殖周期短，是适合于池塘、抗风浪网箱和循环水养殖的重要养殖品种[1]。据联合国粮食及农业组织 (FAO) 统计，2019年全球尖吻鲈养殖总产量约为76 842 t[2]。近年来，随着尖吻鲈人工繁育技术的突破和鱼苗远距离运输技术的发展，该品种已成为广东珠三角地区和海南等地的主要养殖鱼类之一[3-4]。但随着尖吻鲈高密度养殖模式的发展，各种环境应激因子逐渐增加，弧菌和寄生虫导致该品种病害频发，严重制约其养殖业的健康发展[5-8]。水产养殖病害防控的传统方式以抗生素等化学药物为主，易导致养殖对象肠道菌群失衡、抗生素残留和环境污染等诸多问题，不利于水产养殖业的可持续发展[9]。因此，开发高效、绿色的免疫增强剂用以改善尖吻鲈自身免疫抗病机能，是应对其病害问题的新方向。

雨生红球藻 (Haematococcus pluvialis) 隶属于绿藻门、团藻目、红球藻科、红球藻属，富含天然虾青素，广泛分布于自然界中[10]。在不利的生长环境 (如高温、高盐、强光等) 或自然生长后期，雨生红球藻细胞壁变厚，细胞大量积累虾青素[11]。富含虾青素的雨生红球藻既可作为饲料免疫增强剂，也可作为鱼粉替代原料，对水产动物的生长性能、免疫能力和体色具有积极作用。研究表明，饲料中添加雨生红球藻可以提高花鲈 (Lateolabrax maculatus)[12]、河豚 (Takifugu obscurus)[13]和凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei)[14]的生长性能，改善红魔鬼 (Cichlasoma citrinellum)[15]、七彩神仙鱼(Symphysodon haraldi)[16]和红白锦鲤 (Cyprinus carpio haematopterus)[17]的体色，增强黄颡鱼 (Pelteobagrus fulvidraco)[18]、大黄鱼 (Pseudosciaena crocea)[19]和中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis)[20]的免疫力和抗病能力。

目前，国内外未见有关雨生红球藻在尖吻鲈饲料中应用的报道。为此，本实验以尖吻鲈为研究对象，探究在基础饲料中添加不同浓度梯度的雨生红球藻对其生长性能、抗氧化能力、血液学指标及免疫状态的影响，以期为雨生红球藻作为添加剂在尖吻鲈饲料中的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 饲料制备

实验所用饲料配方 (表1) 由中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地自行设计，基础饲料原料购自广东京基智农科技有限公司，雨生红球藻购自西安天广源生物科技有限公司 (虾青素有效质量分数为1.5%，粗蛋白质量分数为22%)。在基础饲料中分别添加0% (C)、0.2% (H1)、0.4%(H2)、0.6% (H3)、0.8% (H4)、1% (H5)的雨生红球藻。实验饲料在中国水产科学研究院南海水产研究所花都试验基地完成制作。用粉碎机粉碎原料后过60 目筛，按配方称量原料，将常量原料混合搅拌均匀，再将微量原料通过逐级扩大混匀的方法加入，混匀后放入搅拌机 (SZ250，广州旭众食品有限公司) 搅拌20 min后取出。将鱼油和大豆卵磷脂与混匀后的原料混合，过60 目筛网后倒入搅拌机搅拌15 min。加入适量的水搅拌15 min后取出，用F-26型双螺杆挤条机 (华南理工大学) 和G-500型造粒机 (华南理工大学) 制成直径为2和2.5 mm的颗粒饲料。自然条件下晾干后，用封口袋密封并做好标签，于-20 ℃保存备用。表1中各组实验饲料的虾青素含量为实测值。

表1 实验饲料组成及营养水平 (干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diet (Dry mass basis)%

1.2 实验鱼与养殖管理

实验鱼由三亚热带水产研究院培育。实验鱼先于池塘网箱暂养2周，期间每天投喂基础料2次。暂养结束后，挑选540尾体表无损伤、游动活泼和平均体质量为 (23.10±0.08) g的尖吻鲈，随机分成1个对照组和5个处理组，每组3个重复，每个重复30尾鱼。养殖实验在池塘网箱进行，持续8周。实验期间，每天7:30和16:30饱食投喂2次，记录饲料投喂量、死鱼的数量和质量。实验期间盐度27～31，水温26.5～30.3 ℃，溶解氧质量浓度大于 6.5 mg·L-1，pH 7.7～8.3，氨氮质量浓度低于 0.05 mg·L-1。

1.3 样品采集

养殖实验结束后，饥饿24 h，将每个网箱的鱼依次全部捞出，用丁香酚麻醉后，称质量计数。从每个网箱中随机取8尾鱼测其体长、体质量，测量完成后，取4尾实验鱼作为全鱼样品，用于营养成分分析；其余4尾用1.5 mL的注射器尾静脉取血，经4 ℃静置1 h后离心，收集上清液并分装于离心管中，-80 ℃保存。采血后，在冰盘上解剖并称量肝脏质量，肝脏分装于2 mL离心管中，-80 ℃保存。

1.4 测定方法

1.4.1 生长指标测定

根据以下公式计算增重率 (WGR, %)、特定生长率 (SGR, %·d-1)、饲料系数 (FCR)、成活率 (SR,%)、肝体比 (HSI, %) 和肥满度 (CF, g·cm-3)：

式中：Wt为鱼终末均质量；W0为鱼初始均质量；t为实验天数 (56 d)；Nt为终末鱼数；N0为初始鱼数 (30尾)；FI为饲料投喂量；Wt总为鱼终末总质量；W0 总为鱼初始总质量；Wg为肝脏质量；Wf为鱼体质量；Lf为鱼体长。

1.4.2 饲料和全鱼基本成分测定

分别采用105 ℃烘箱干燥法、凯氏定氮法、索氏抽提法和550 ℃马弗炉焚烧失重法测定饲料和全鱼中水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分的含量。

1.4.3 饲料虾青素含量测定

取各组饲料200 g，送至广东恒兴饲料实业股份有限公司质量检测中心测定虾青素含量，检测方法参照SN/T 2327—2009《进出口动物源性食品中角黄素、虾青素的检测方法》。

1.4.4 抗氧化酶活性测定

肝脏中总抗氧化能力 (T-AOC)、超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 活性及丙二醛 (MDA) 浓度采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定。

1.4.5 血液生理指标和免疫指标测定

采用迈瑞BC-5300Vet全自动五分类动物血液细胞分析仪测定血液的白细胞数 (WBC)、红细胞数 (RBC)、血红蛋白浓度 (Hb) 和红细胞积压(Ht)。血清中总胆固醇 (TCHO)、甘油三酯 (TG)、高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C)、血糖 (GLU)、皮质醇 (Cortisol) 浓度均采用全自动生化分析仪进行测定 (日立7600-110)，所用试剂盒均购自四川迈克生化技术有限公司。溶菌酶 (LZM) 活性、补体4 (C4) 和免疫球蛋白M (IgM) 浓度测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，具体方法参照试剂盒说明书。

1.5 数据处理

所测数据采用Excel 2006软件进行处理，通过SPSS 20.0进行统计分析，所得数据以“平均值±标准差 ()”表示，P＜0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 生长性能

各处理组实验鱼的增重率和特定生长率均大于对照组 (表2)，其中H2、H3、H4和H5组均与对照组差异显著 (P＜0.05)，H1组与对照组差异不显著 (P＞0.05)；当雨生红球藻添加量超过0.6%，实验鱼的增重率和特定生长率均呈下降趋势。各处理组实验鱼饲料系数和肝体比均小于对照组，但差异不显著 (P＞0.05)。各处理组实验鱼成活率和肥满度均大于对照组，但无显著性差异 (P＞0.05)。以尖吻鲈增重率为因变量 (y)，以雨生红球藻添加量为自变量 (x)，对二者进行回归分析，得出尖吻鲈饲料中雨生红球藻的最适添加量为0.66% (图1)。

图1 尖吻鲈增重率与饲料中雨生红球藻添加量的关系Fig. 1 Relationship between weight gain rate of L. calcarifer and content of dietary H. pluvialis

表2 饲料中添加雨生红球藻对尖吻鲈生长性能的影响Table 2 Effect of dietary H. pluvialis on growth performance of L. calcarifer

2.2 全鱼体成分

处理组全鱼的粗脂肪质量分数低于对照组(表3)，其中H3、H4和H5组均与对照组差异显著 (P＜0.05)。与对照组相比，处理组全鱼的水分、粗蛋白质和灰分质量分数无显著性差异 (P＞0.05)。

表3 饲料中添加雨生红球藻对尖吻鲈全鱼营养成分的影响Table 3 Effect of dietary H. pluvialis on whole body proximate composition of L. calcarifer%

2.3 肝脏抗氧化能力

处理组实验鱼肝脏的T-AOC高于对照组 (表4)，H2、H3、H4和H5组显著高于对照组 (P＜0.05)。添加雨生红球藻组实验鱼肝脏的CAT、SOD和GSH-Px活性降低，H2、H3、H4和H5组与对照组差异显著 (P＜0.05)。与对照组相比，处理组的丙二醛浓度显著降低 (P＜0.05)。

表4 饲料中添加雨生红球藻对尖吻鲈肝脏抗氧化指标的影响Table 4 Effect of dietary H. pluvialis on hepatic T-AOC, SOD, CAT, GSH-Px activities and MDA contents of L. calcarifer

2.4 血液生理指标

实验鱼红细胞数和血红蛋白质量浓度随着雨生红球藻添加水平的增加而增加 (表5)，H3、H4和H5组显著高于对照组 (P＜0.05)。对照组和雨生红球藻添加组的白细胞数和红细胞积压水平差异不显著 (P＞0.05)。

表5 饲料中添加雨生红球藻对尖吻鲈血液生理指标的影响Table 5 Effect of dietary H. pluvialis on blood physiological parameters of L. calcarifer

2.5 血清生化指标

与对照组相比，处理组实验鱼血清TCHO、TG和LDL-C浓度降低 (表6)，H2、H3、H4和H5组的TCHO和TG浓度显著低于对照组 (P＜0.05)，H3、H4和H5组的LDL-C浓度显著低于对照组 (P＜0.05)。对照组和处理组的HDL-C、血糖和皮质醇浓度差异不显著 (P＞0.05)。

表6 饲料中添加雨生红球藻对尖吻鲈血清生化指标的影响Table 6 Effect of dietary H. pluvialis on serum biochemical parameters of L. calcarifer

2.6 血清免疫指标

雨生红球藻添加组实验鱼的溶菌酶活性、免疫球蛋白M和补体4浓度高于对照组 (表7)，H2、H3、H4和H5组的溶菌酶活性和免疫球蛋白M浓度显著高于对照组 (P＜0.05)，H3、H4和H5组的补体4浓度显著高于对照组 (P＜0.05)。

表7 饲料中添加雨生红球藻对尖吻鲈血清免疫指标的影响Table 7 Effect of dietary H. pluvialis on serum immune indexes of L. calcarifer

3 讨论

3.1 雨生红球藻对尖吻鲈生长的影响

本实验表明，在饲料中添加适量雨生红球藻能显著改善尖吻鲈的生长性能。随着雨生红球藻添加量的增加，尖吻鲈生长性能呈现先升高后降低的趋势，当雨生红球藻添加量增至0.6% 时，增重率和特定生长率最大；此后当雨生红球藻添加量继续增加，尖吻鲈生长性能下降，说明添加适量的雨生红球藻才能最大程度促进尖吻鲈生长。这与雨生红球藻对花鲈[12]、七彩神仙鱼[16]、红白锦鲤[17]和血鹦鹉 (Cichlasoma citrinellum♀ ×C. synspilum♂)[21]生长性能影响的研究结果相互印证。雨生红球藻富含虾青素、多糖、藻蛋白和矿物质等活性物质，对水生动物的生长有显著的促进作用[10]。另外，雨生红球藻中的虾青素能够促进动物体内维生素 A 的合成，而维生素A是鱼类生长发育和正常生理功能必需的维生素，对鱼类生长有促进作用[22]。本研究中，当雨生红球藻添加量超过0.6%，尖吻鲈的增重率和特定生长率均呈下降趋势，表明过量添加雨生红球藻在一定程度上会抑制其生长，这与雨生红球藻对锦鲤 (C. carpio)[22]、乌鳢 (Channa argus)[23]、大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)[24]和棘颊雀鲷 (Premnas biaculeatus)[25]生长性能影响的研究结果相吻合。过量添加雨生红球藻的饲料中虾青素含量也相应增大，而过量的虾青素会导致鱼体代谢增强，从而把多余的营养物质排出体外，造成耗能增加，进而抑制其生长[22]。以增重率为目标，经回归分析，尖吻鲈饲料中雨生红球藻的最适添加量为0.66% (虾青素质量分数为99 mg·kg-1)。这一结果高于花鲈 (69.79 mg·kg-1)[12]和鲤 (50 mg·kg-1)[26]对虾青素的需求量，但低于七彩神仙鱼(300 mg·kg-1)[16]。说明虾青素促生长作用的最适饲料添加量存在品种依赖效应。

3.2 雨生红球藻对尖吻鲈全鱼体成分的影响

全鱼体成分体现鱼类营养价值，会随着生长环境和饲料营养水平不同而变化[27]。饲料中添加适量雨生红球藻可以改善养殖动物肉质品质[28]。本实验中，饲料中添加雨生红球藻可以降低全鱼粗脂肪质量分数，其中H3、H4和H5组全鱼的粗脂肪质量分数显著低于对照组 (P＜0.05)。与本研究结果相似，Yu等[12]研究发现用添加雨生红球藻的饲料投喂花鲈后，全鱼粗脂肪质量分数显著降低；Kalinowski等[29]报道虾青素可以通过提高脂肪利用率而降低真鲷 (Pagrus major) 全鱼的脂肪含量。

3.3 雨生红球藻对尖吻鲈肝脏抗氧化状态的影响

鱼类T-AOC反映了体内抗氧化酶和非酶抗氧化物的水平，是衡量机体抗氧化系统功能状况的综合性指标[30]。王磊等[16]在雨生红球藻对七彩神仙鱼抗氧化状态影响研究中发现，雨生红球藻能显著提升实验鱼的T-AOC。吴仁福等[31]研究表明饲料中添加雨生红球藻可以显著提高三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus) 肝脏的T-AOC。本实验结果与上述研究结果相似，饲料中添加雨生红球藻能显著提高尖吻鲈肝脏的T-AOC。雨生红球藻所含天然虾青素以反式结构为主，且其脂类配比与鱼类自身配比也相近，易被鱼体吸收，对清除自由基有明显作用，因此雨生红球藻能增强养殖鱼类的TAOC[31]。本研究中，添加0.2%的雨生红球藻对TAOC无显著影响，而添加0.4%～1%的雨生红球藻可显著提高T-AOC。因此，从提升总抗氧化状态考虑，雨生红球藻在尖吻鲈饲料中的添加水平应高于0.4%。

鱼体有氧代谢产生的自由基容易与蛋白质、脂质和核酸等发生反应，造成脂质过氧化和核酸损伤，从而对鱼体造成氧化损伤[9]。SOD、CAT和GSH-Px活性与清除自由基功能密切相关，可以保护机体大分子和细胞器免受氧化损伤[30]。本实验中，尖吻鲈肝脏SOD、CAT和GSH-Px活性随着雨生红球藻添加量的增加而显著降低，这与雨生红球藻对大黄鱼[19]、中华绒螯蟹[32]和牙鲆 (Paralichthys olivaceus)[33]肝脏抗氧化酶影响的研究结果相似。分析其可能的原因是由于雨生红球藻富含的虾青素可以清除鱼体内过多的自由基，减少了抗氧化酶的反应底物，最终导致鱼体肝脏 SOD、CAT和GSH-Px活性降低[31]。

MDA是脂质过氧化反应的产物，会导致细胞毒性并损伤细胞和组织，是反映脂质过氧化程度的重要指标[9]。本研究中，H2、H3、H4和H5组尖吻鲈肝脏MDA浓度显著低于对照组，说明雨生红球藻能有效减少鱼体脂质过氧化物的积累，这与对花鲈、七彩神仙鱼和红白锦鲤的研究结果相符[14,16-17]。

3.4 雨生红球藻对尖吻鲈血液生理指标的影响

鱼类的血液生理指标是评价其健康水平的主要指标之一[12]。本实验中，尖吻鲈的红细胞和血红蛋白水平随着饲料中雨生红球藻添加量的增加而升高，H3、H4和H5组显著高于对照组 (P＜0.05)。与本研究结果相似，Li等[19]研究发现，雨生红球藻及虾青素均能显著提高大黄鱼红细胞和血红蛋白水平；崔培等[34]对锦鲤的研究发现，在饲料中添加虾青素后，锦鲤的红细胞和血红蛋白水平显著升高。机体低水平的红细胞和血红蛋白水平与细胞膜过氧化损伤有关[35]。细胞膜过氧化损伤会引起细胞膜脂肪酸的组成发生变化，导致造血系统生成血细胞的效率降低[36-37]。本研究中，雨生红球藻中的虾青素能提高尖吻鲈的抗氧化状态，降低鱼体的过氧化损伤，在提高其红细胞和血红蛋白水平中可能起到重要作用。

3.5 雨生红球藻对尖吻鲈血清生化指标的影响

鱼类的血清生化指标是反映鱼类机体健康状况的重要指标，被广泛用来评价鱼类健康状况、营养状况及对环境的适应状况[12]。TG是机体内存在最多的脂类，其含量高低与动脉样硬化性心血管疾病密切相关，TCHO是血液中所含胆固醇之和[38]。本研究显示，雨生红球藻可以显著降低尖吻鲈血清的TCHO和TG浓度，这一结果与Yu等[12]和Li等[19]的研究结果类似，他们发现饲料中添加雨生红球藻可以降低花鲈和大黄鱼血清的TCHO和TG浓度。其原因是雨生红球藻中的虾青素可以降低动物体内血脂含量[39]。LDL-C是鱼体运输胆固醇的主要载体，其浓度与心血管疾病的发生存在紧密的正相关，鱼类LDL-C浓度的降低可以减少胆固醇在肝脏与血管中的累积，提高机体健康水平[38]。本研究中，处理组尖吻鲈血清LDL-C浓度较对照组低，H3、H4和H5组的LDL-C浓度显著低于对照组 (P＜0.05)。黄河儒等[40]研究也表明，雨生红球藻可以显著降低小鼠 (Mus musculus) LDL-C的浓度。雨生红球藻调控LDL-C浓度的具体机制有待进一步研究。

3.6 雨生红球藻对尖吻鲈血清免疫指标的影响

研究表明雨生红球藻可以增强动物机体的免疫功能[10]。LZM和补体广泛分布于体液中，在鱼类非特异性免疫机制中担任重要角色，是评价鱼类免疫能力的重要指标[30]。C4是鱼体内具有酶原活性的球蛋白，具有破坏或清除病原微生物的功能[9]。IgM主要存在于鱼类血液中，能与补体相结合，在鱼体免疫应激中发挥重要作用[23]。本研究中，处理组尖吻鲈的LZM活性、C4和IgM浓度均大于对照组，表明雨生红球藻可以增强实验鱼的免疫应答能力。Yu等[12]和Li等[19]获得了类似的结果，他们发现雨生红球藻可以提升花鲈和大黄鱼的LZM活性、C4和IgM浓度。其原因可能是雨生红球藻中的虾青素既可以通过增强抗体分泌细胞功能，促进LZM等免疫活性物质的分泌，还能够激活补体系统，促进C4和IgM等免疫物质的分泌[23]。以上结果表明，饲料中添加雨生红球藻可以调节养殖鱼类的免疫系统，提高机体非特异性免疫力。

4 结论

在尖吻鲈饲料中添加适量的雨生红球藻能显著促进其生长，降低全鱼脂肪含量，增强抗氧化能力和免疫能力。回归分析结果表明，以增重率为目标，尖吻鲈饲料中雨生红球藻的最适添加量为0.66%。