非根际土壤丛枝菌根菌丝体和碳酸钙对不同粒径土壤团聚体氮磷养分的影响*

方正圆，谢佩耘，郭云,，韩勖，何跃军

(1.贵州大学 林学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州民族大学 生态环境工程学院，贵州 贵阳 550025)

由碳酸盐岩发育形成的喀斯特生态系统在我国南方广泛分布[1]。碳酸盐岩主要化学成分是碳酸钙，碳酸钙离解后形成高浓度的Ca2+导致土壤钙含量高，形成钙质土壤[2]。研究发现高浓度钙能增加土壤磷的固定，但降低磷有效性[3]。因此，土壤碳酸钙含量的高低可能影响土壤团聚体机械组成并进一步影响植物生长。有研究发现碳酸钙离解后形成的碳酸氢根离子可被植物根系吸收转运并存储至植物叶片细胞补偿植物的光合碳[4-6]，这一过程可能由土壤微生物介导完成。丛枝菌根(arbuscular mycorrhizae,AM)真菌是自然界普遍存在的一种功能微生物，可与近85%的植物根系形成菌根共生体[7]。AM真菌在调控生态系统养分循环中发挥着重要作用[8]，如AM能吸收各种简单形态的氮[9]，分解有机物促进养分释放[10]，增加植物根系分泌的磷酸酶增进土壤磷的有效性[11]，并通过菌丝体吸收土壤有效磷影响植物生长发育[12]。这一过程主要通过AM菌丝体在土壤根际共生界面完成。

根际(rhizosphere)是指植物根系周围与土界面不足一毫米至几毫米的微区土壤范围[13]，超过此范围应视为非根际(non-rhizosphere)土壤。根际土壤养分是最能被植物根系吸收利用的，受植物根系活动影响，根际土壤与非根际土壤理化性质如磷酸酶活性具有明显差异[14]。已有研究者对根际和非根际土壤开展过一些研究工作，主要集中在根际与非根际土壤养分、土壤理化性质、微生物多样性差异研究[15-21]。土壤团聚体是土壤质量评价的重要指标之一，养分在不同团聚体的含量存在显著差异[22]。AM共生体主要是AM真菌通过菌丝体侵染根系皮层细胞后形成，根系外延菌丝体往往超过根际土壤范围，并将远距离的非根际土壤养分吸收转移供给宿主植物利用，在非根际土壤中代替植物根的功能[23]。因此，非根际土壤质量对AM菌丝体促进宿主植物养分利用也可能产生重要影响，特别是退化贫瘠的土壤中植物根系外延AM菌丝体更加可能扮演着重要角色。

高钙的喀斯特土壤中，AM真菌是如何通过根系外延菌丝体与碳酸钙交互作用影响非根际土壤团聚体养分变化的问题尚不清楚。研究这一问题将有助于深入探索高钙喀斯特生境中AM真菌对植物生长和土壤的功能机制，并可为喀斯特地区采用丛枝菌根技术改良土壤、促进植被修复提供理论依据。因此，本研究通过2个连体隔室(根际土壤隔室和非根际土壤隔室)组成的装置，对根际土壤隔室进行接种丛枝菌根真菌处理，对非根际土壤隔室进行施加以及不施加碳酸钙处理，最终将收获的非根际土壤隔室的土壤分为<0.25 mm、0.25～1.00 mm、1.00～2.00 mm、>2.00 mm共4个土壤粒径进行研究分析，以期为喀斯特地区AM真菌的利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

为研究AM菌丝体和碳酸钙对非根际土壤养分和植物生长的影响，本研究设计根际隔室(rhizosphere soil compartment，R)和非根际隔室(non-rhizosphere soil compartment，N)连体组成的微生态系(Microcosm)。R隔室和N隔室间用厚度1 mm的隔板隔离两侧土壤，隔板两侧用孔径为20 μm或0.45 μm尼龙网张附，隔板两侧形成1 mm的空气隔层(Air gap)。R隔室中种植樟树(Cirtnamomumcamphora)幼苗，并接种AM真菌幼套球囊霉(Glomusetunicatum)，N隔室土壤中施加4 g碳酸钙粉末。每个隔室由聚乙烯材料制成(长×宽×高 = 110 mm×110 mm×118 mm)，隔板沿对角线钻5个直径10 mm的圆孔，中心孔与其余4个孔间距为30 mm。隔室底部开凿6个0.5 cm直径的圆孔防止土壤积水。

1.2 试验处理

试验采用AM菌丝体处理和施加外源碳酸钙处理。M+处理：在R隔室和N隔室之间用20 μm尼龙网，菌丝体可从R隔室穿透尼龙网向N隔室内生长，但阻隔R中植物根系的生长；M-处理：在R隔室和N隔室之间用0.45 μm尼龙网隔离，用以阻隔R中的菌丝体和根系向N中生长。C+处理：在N隔室中施加外源碳酸钙粉末；C-处理：在N隔室中不施加外源碳酸钙粉末。实验开始前，每个R隔室中先放入1 100 g灭菌土壤基质(石灰土+河沙按3︰1比例混匀，基质理化性质为：pH值6.92，全氮2 160 mg/kg，碱解氮137.43 mg/kg，全磷170 mg/kg，和有效磷19.58 mg/kg；石灰土采集于贵阳市花溪区典型喀斯特地段)，再放入50 g 幼套球囊霉菌剂(菌种购于北京农林科学院营养资源研究所，BGA0046，用三叶草(Trifoliumrepens)在石灰土基质上扩繁4个月后，收获土壤基质作为菌剂，孢子密度≥10个/g)，播入6粒樟树种子(种子采集于贵阳市花溪区典型喀斯特地段，低温保存1个月后用0.1%高锰酸钾溶液消毒10 min，无菌水冲洗3次)，再添加350 g灭菌基质覆盖表层。N隔室中直接放入1 450 g灭菌土壤基质。处理完毕后浇足水分放置在贵州大学南校区温室大棚中培养1个月，樟树苗木出土后间苗，每个R隔室留3株生长一致的幼苗，苗木生长5周后在每个N隔室放入4 g的CaCO3粉末，碳酸钙处理8周后收获所有N隔室土壤，经自然风干后过筛分成<0.25 mm、0.25～1.00 mm、1.00～2.00 mm、>2.00 mm共4个粒径土样装入锡箔纸，并进行指标测定。

图1 试验设计示意图Fig.1 Schematic diagram of experimental design

1.3 指标测定与数据分析

N含量测定采用凯氏定氮法[24](用瑞士BÜCHI公司生产的Distillation Unit B-324全自动凯氏定氮仪测定)；P素测定采用钼锑抗比色法[25]。采用SPSS 19.0进行数据分析，通过Three-way ANOVAs三因素方差分析非根际土壤中不同土壤粒径(<0.25 mm、0.25～1.00 mm、1.00～2.00 mm、>2.00 mm)、AM菌丝体(M+，M-)和碳酸钙(C+，C-)及他们的交互作用对土壤氮磷养分的影响，并用Origin 2018完成制图。

2 结果与分析

2.1 非根际土壤AM菌丝体和碳酸钙对不同粒径土壤团聚体全氮含量的影响

如表1所示，AM菌丝体、碳酸钙和土壤粒径对非根际土壤全氮含量均具有极显著影响(P<0.01)；菌丝体×粒径、碳酸钙×粒径的交互作用对土壤全氮含量具有极显著影响(P<0.01)，菌丝体×碳酸钙以及菌丝体×碳酸钙×粒径的交互作用对土壤全氮没有显著影响。

表1 非根际土壤菌丝体和碳酸钙以及土壤粒径对土壤全氮含量影响的三因素方差分析Tab.1 Three-way ANOVAs for effects of AM mycelium,calcium carbonate and soil particle in non-rhizosphere soil compartment on the total nitrogen

图2 非根际土壤中不同粒径土壤全氮含量(平均值±标准误)Fig.2 The total nitrogen(TN)in non-rhizosphere soil with different particle soil size(mean±SE)

如图2所示，比较C+与C-处理间差异，在粒径<0.25 mm土壤全氮含量均表现为C+显著高于C-处理；同样，在>2.00 mm的土壤中全氮含量表现为C+极显著高于C-处理；但在0.25～1.00 mm和1.00～2.00 mm粒径土壤中C+与C-处理之间没有显著差异。

比较M+与M-处理间差异，在<0.20 mm和>2.00 mm土壤中全氮含量无论是C+还是C-中均表现为M+显著高于M-处理；0.25～1.00 mm粒径土壤中无论C+或是C-处理下，M+处理均高于M-处理，但差异不显著；1.00～2.00 mm粒径中M+与M-差异均不显著。

以上结果表明非根际土壤隔室中的AM菌丝体和施加的外源碳酸钙对土壤全氮含量产生影响，主要的影响为提高<0.25 mm和>2.00 mm土壤全氮含量，对中粒径土壤则影响不显著。

2.2 非根际土壤AM菌丝体和碳酸钙对不同粒径土壤碱解氮含量的影响

如表2所示，AM菌丝体对碱解氮含量没有显著影响(P>0.05)，而施加碳酸钙处理显著影响了碱解氮含量(P=0.027)，菌丝体×碳酸钙、菌丝体×粒径、碳酸钙×粒径以及菌丝体×碳酸钙×粒径交互作用对非根际土壤的碱解氮含量均没有显著影响。

表2 非根际土壤菌丝体和碳酸钙以及土壤粒径对土壤碱解氮含量影响的三因素方差分析Tab.2 Three-way ANOVAs for effects of AM mycelium,calcium carbonate and soil particle in non-rhizosphere soil compartment on the alkaline nitrogen

图3 非根际土壤中不同粒径土壤碱解氮含量(平均值±标准误)Fig.3 The alkaline nitrogen(AN)in non-rhizosphere soil with different particle soil size(mean±SE)

如图3所示，比较C+与C-处理间差异，在土壤粒径>2.00 mm的M+与M-处理中，土壤碱解氮含量C+显著高于C-处理，其余处理差异不显著；比较M+与M-处理，无论C+还是C-处理，M+与M-之间的土壤碱解氮差异均不显著。该结果表明非根际土壤中碳酸钙能够显著提高较大粒径土壤中碱解氮的含量，但菌丝体对土壤碱解氮的效应不明显。

2.3 非根际土壤AM菌丝体和碳酸钙对不同粒径土壤全磷含量的影响

如表3所示，土壤粒径对全磷含量具有极显著影响(P<0.001)，菌丝体和碳酸钙处理对全磷含量没有显著影响，仅有菌丝体×粒径交互作用对土壤全磷含量具有显著影响，其余交互作用无显著效应。

如图4所示，比较C+与C-处理间差异，仅有>2.00 mm的M-处理下C+显著低于C-，M+处理下C+也略低于C-，但差异不显著，其余M+与M-处理的C+与C-处理全磷含量差异也均不显著；比较M+与M-处理差异，在>2.00 mm的C-处理下M+显著高于M-，其余粒径无论是C+还是C-处理下的M+与M-差异均不显著。

表3 非根际土壤菌丝体和碳酸钙以及土壤粒径对土壤全磷含量影响的三因素方差分析Tab.3 Three-way ANOVAs for effects of AM mycelium,calcium carbonate and soil particle in non-rhizosphere soil compartment on the total phosphorus

图4 非根际土壤中不同粒径土壤全磷含量(平均值±标准误)Fig.4 The total phosphorus(TP)in non-rhizosphere soil with different particle soil size(mean±SE)

2.4 非根际土壤AM菌丝体和碳酸钙对不同粒径土壤有效磷含量的影响

如表4所示，AM菌丝体显著影响非根际土壤的有效磷含量(P=0.002)，土壤粒径对非根际土壤的有效磷含量有极显著影响(P<0.001)。交互作用菌丝体×碳酸钙、碳酸钙×粒径以及菌丝体×碳酸钙×粒径对非根际土壤的有效磷含量影响不显著；菌丝体×粒径则对有效磷含量具有显著影响(P<0.05)。

如图5所示，比较C+与C-处理间有效磷含量的差异，无论M+还是M-中的C+与C-处理之间土壤有效磷含量均无显著差异；比较M+与M-，在>2 mm粒径土壤的C+和C-中，M+处理的有效磷含量显著高于M-处理，其余条件土壤的M+与M-之间有效磷含量差异均不显著。该结果表明，非根际土壤中AM菌丝体对较大粒径如>2 mm土壤的有效磷含量具有调节作用。

表4 非根际土壤菌丝体和碳酸钙以及土壤粒径对土壤有效磷含量影响的三因素方差分析Tab.4 Three-way ANOVAs for effects of AM mycelium,calcium carbonate and soil particle in non-rhizosphere soil compartment on the available phosphorus

图5 非根际土壤中不同粒径土壤有效磷含量(平均值±标准误)Fig.5 The available phosphorus(AP)in non-rhizosphere soil with different particle soil size(mean±SE)

3 讨论与结论

3.1 讨论

根际是附着于植物根系表面和根系周围的微域环境，对植物的生长活动起到至关重要的作用[26]。丛枝菌根共生影响根际土壤微生物及生物酶的分泌，并通过AM菌丝改变根际土壤性状[27]，同时生物酶的分泌可促进根际养分元素转化并调节改良根际土壤[28]。本试验结果发现AM菌丝体显著提高小粒径(<0.25 mm)与大粒径(>2.00 mm)的土壤团聚体全氮含量。研究发现AM菌丝体所产生的代谢产物球囊霉素相关蛋白(Glomalin related soil protein，GRSP)与土壤全氮极显著正相关，是土壤氮的重要来源[29]。因此，非根际土壤中AM菌丝体提高团聚体氮含量可能与其产生的GRSP有关。这也说明非根际土壤中的AM菌丝体对土壤养分转化过程有重要调节功能。

由于喀斯特生态系统中碳酸盐岩的主要成分是碳酸钙，离解后可形成高浓度的Ca2+，同时也有研究表明高浓度的Ca2+可使AM菌丝顶端钙离子梯度增加，促进AM菌丝的极性生长[30]。李少朋等[31]向AM真菌接种的土壤中施加外源钙后，土壤理化性质发生变化。本研究发现，非根际土壤中AM菌丝体和碳酸钙共同作用下提高土壤氮含量和磷含量是在较小粒径(<0.25 mm)和较大粒径(>2.00 mm)条件下。这与郭雪姣等[32]研究发现土壤氮主要分布在土壤较大和较小粒径中结果一致。土壤外源碳酸钙添加，碳酸钙离解后形成的钙离子与有机碳可结合形成稳定的钙键复合体[33]。因此，本研究增加的外源碳酸钙在AM菌丝体作用也可能促进土壤钙键复合体形成，并改变土壤团粒结构。一方面，AM菌丝在土壤中的周转速率大约5～6 d[34]，AM菌丝体在2～3周后自溶释放出无机养分[35]，小粒径团聚体中附着更多的菌丝体自溶氮，且小粒径团聚体具有更小的比表面积，吸附能力较强[36]。因此，小粒径团聚体具有较大的土壤颗粒比表面积进而导致更大的养分含量。另一方面，大粒径土壤团聚体是由微团聚体在有机质及真菌菌丝体等的胶结作用下形成[37]；即便其土壤颗粒比表面积较小，但碳酸钙的添加形成稳定的钙键复合体可增加土壤的胶黏性[38]，而AM菌丝体缠绕或由于其代谢产物的胶结作用也可导致较大粒径团聚体形成[39]，进一步地通过菌丝体自溶作用释放养分提高了大粒径团聚体氮含量。有研究表明，适量添加碳酸钙可改变土壤氮素的循环过程[40]，本研究结果也显示，碳酸钙对土壤氮具有显著影响。虽然本研究发现AM菌丝体和外源碳酸钙添加可促进较大和较小粒径土壤团聚体养分含量，但其作用机制仍需进一步深入探索。因此，通过同位素示踪并结合分子生物学技术，研究AM菌丝体与碳酸钙互作调控影响根际与非根际土壤团聚体形成与养分变化过程及其作用机制是未来值得探索的研究方向。

3.2 结论

AM菌丝体能够显著影响非根际土壤全氮和有效磷含量，外源碳酸钙增加显著影响全氮和碱解氮含量，不同粒径团聚体大小对全氮、全磷和有效磷具有显著影响。AM菌丝体与土壤团聚体粒径交互影响土壤全氮、全磷和有效磷含量，而碳酸钙添加与粒径的交互作用仅显著影响土壤全氮含量。非根际土壤中AM菌丝体和碳酸钙互作能改善提高较大粒径和较小粒径土壤团聚体氮、磷含量。