不同脱脂试剂对家兔骨骼标本脱脂效果的影响

牟思洋，王向群，星宗伯，李伟琪，聂凡皓，于雷

（青岛农业大学海都学院，山东 烟台 265200）

动物骨骼标本是观察动物体基本结构和形态架构最直接、最简单的施教工具之一[1-3]，且在使用过程中具有不受时间和地点局限的优点。动物骨骼标本的制作一般包括剥皮取肉、脱脂、漂白、拼接、保养等环节。由于骨骼的骨骼腔和骨松质中含有一定的脂肪成分，且脂肪往往存在于骨骼内部或腔隙过小的部位。若处理不当，脂肪便会慢慢溢出，使骨骼发黄、发黑，影响美观，进而缩短骨骼标本的使用寿命。因此，脱脂是骨骼标本制作中至关重要的环节[4]。目前，骨骼标本制作使用的脱脂试剂多为氢氧化钠（NaOH）等碱性试剂，尽管脱脂效果佳，但其具有的腐蚀性对致密程度较低的骨骼破坏性较大[5]。脂肪酶可水解甘油三酯等油性物质，可催化酯水解、酯合成、酯交换等有机反应[6-8]，目前主要应用于皮革等物品的脱脂[9-10]，但关于脂肪酶在骨骼标本制作中脱脂的应用与研究尚未见报道。本研究选取了脂肪酶、氢氧化钠、丙酮、氢氧化钾等4种试剂对家兔骨骼进行脱脂处理，以了解脂肪酶在骨骼标本中的脱脂效果，为骨骼标本的制作提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选择成年健康家兔4只，购自山东省莱阳市某活鸡店，平均体重约2.5 kg，取下四肢，分别记为1、2、3、4号。

1.2 试验仪器

解剖盘、手术刀、手术剪、电磁炉、铁锅、电子天平等均由青岛农业大学海都学院基础兽医学实验室提供。

1.3 试验试剂

胰蛋白酶（国药集团）、脂肪酶（北京鸿润宝顺生物科技有限公司）、丙酮溶液（青岛农业大学海都学院基础兽医学实验室）、3%过氧化氢溶液成品（山东利尔康医疗科技股份有限公司）、10%氢氧化钾溶液（福州飞净生物科技有限公司）；其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.4 试验方法

1.4.1 家兔处死

家兔提前禁食1 d，为最大程度降低家兔骨骼损伤采用空气栓塞法处死。

1.4.2 剥皮去肉

在避免损伤骨骼的基础上，分离死亡的家兔四肢与躯干。四肢毛皮环切剥下，剔除大块肌肉、组织等附着物。家兔骨骼按照不同兔子的前肢、后肢分组浸泡于胰蛋白酶溶液内，浸泡1～2 d后取出，清水洗净、晾干。其中胰蛋白酶溶液按照胰蛋白酶∶蒸馏水=1∶500的比例配制。

1.4.3 脱脂

4只家兔的四肢依次放入饱和脂肪酶、丙酮、3%氢氧化钠和3%氢氧化钾溶液中进行脱脂。其中饱和脂肪酶置于37℃恒温箱中以保持酶的活性，其余试剂在室温下脱脂。记录在相同时间内4种脱脂剂的脱脂效果。于脱脂后的8、16和24 h观察并记录骨骼色泽、洁白度、骨骼松弛度、残留附着度及骨骼表面油脂浸出等情况。待观察记录完毕后将骨骼洗净，晾干。

1.4.4 漂白

使用3%过氧化氢对脱脂后的骨骼进行漂白，浸泡24 h观察并记录骨骼及韧带完整性、颜色和光泽度。漂白完成后，重复清洗2～3次，阴干，观察记录最终漂白效果。1.4.5保存

在常温和保持通风的条件下，漂白后的骨骼于阴凉干燥处避光保存150 d后观察期保存效果。

2 结果与分析

2.1 4种试剂处理家兔骨骼的去肉效果（见图1）

由图1可知，胰蛋白酶对于骨骼上的软组织处理效果较好，除少部分难以消化的筋外，骨骼表面肌肉、角质化物质柔软易去，经冲洗后均脱落，骨骼缝隙的细小肉丝也已去除干净。晾干后，骨体表面开始有油脂浸出，呈黄白色交替，且骨股头出现黑色骨髓沉积。

图1 4种试剂处理家兔骨骼的去肉效果Fig.1 Meat removal effect of four kinds of reagents in treating rabbit bones

2.2 4种试剂处理家兔骨骼的脱脂效果（见表1）

由表1可知，脂肪酶在24 h脱脂后可达到预期效果，脱脂充分且骨骼未遭到损伤；丙酮在24 h后未达到预期效果，骨骼无损伤但脱脂不充分；3%氢氧化钠溶液和3%氢氧化钾溶液在24 h后脱脂达到预期效果，脱脂充分但骨骼的硬度和质地存在一定损伤。

表1 4种试剂处理家兔骨骼的脱脂效果Tab.1 Degreasing effect of four kinds of reagents on rabbit bones

2.3 4种试剂处理家兔骨骼的漂白效果（见图2、表2）

图2 漂白后的家兔骨骼Fig.2 Rabbit bones after bleaching

由图2、表2可知，从骨体完整度角度考虑，经脂肪酶、丙酮脱脂后的骨骼再经过氧化氢漂白后，骨体坚硬无损伤；氢氧化钠及氢氧化钾脱脂后的骨骼经漂白后均有不同程度的损伤，如裂隙、硬度下降等。从骨骼颜色角度考虑，经脂肪酶脱脂的骨骼颜色发白，光泽发亮，附着污物少。综合整体考虑，使用脂肪酶脱脂的骨骼经漂白后的骨体完整度和骨骼颜色最优。

表2 家兔骨骼漂白后效果比较Tab.2 Comparison of effects of rabbit bones after bleaching

2.4 4种试剂处理家兔骨骼的保存效果（见表3）

由表3可知，由于前期脱脂时经过间较短，仍存在部分油脂渗出情况，但脂肪酶在油脂渗出最少的情况下仍保持着骨质完整度高、骨质好、骨骼较白的效果。丙酮虽然达到脱脂目的但完成度不及脂肪酶，且整体泛黄。氢氧化钠和氢氧化钾不仅油脂渗出和脂肪残留较上述两种试剂多，而且腐蚀痕迹严重。

表3 4种试剂处理家兔骨骼的保存效果Tab.3 Preservation effect of four kinds of reagents in treating rabbit bones

3 讨论

3.1 试验动物的选取

制作骨骼标本前，应注意家兔的年龄和体型。家兔年龄过小、过大或体型瘦弱、发育不良，制作的骨骼易出现形态结构不明显或骨质脆弱的现象，进而导致骨骼标本最后价值受到影响[5]。而家兔体型过于肥胖或年龄过大，附着在骨骼上的脂肪多于正常体型的家兔，将延长骨骼脱脂的时间，加大试剂使用剂量，还提高了脱脂不到位的风险。

3.2 腐蚀去肉的方法

骨骼标本制作方法中，传统的虫噬法、土埋法等制作周期过长且污物残留较难清洗干净[11]，化学试剂腐蚀法多选用氢氧化钠溶液。氢氧化钠溶液虽然可以很大程度地软化水解蛋白质，但经过人工剔除的骨骼大部分骨体裸露，氢氧化钠对骨骼具有一定的直接腐蚀作用。

本研究中使用胰蛋白酶进行腐蚀去肉，胰蛋白酶可催化水解碱性氨基酸所形成的肽键，有效去除骨骼附着肌肉及残留物[12]。与传统的虫噬法以及氢氧化钠浸泡法相比，蛋白酶不会对骨骼本身产生不可逆的影响，可最大限度地保留骨骼的完整性，避免了对骨骼的伤害且缩短了制作周期。胰蛋白酶对人的伤害性低[13]，对环境无污染，无需担心废液排入下水道造成污染的问题。

3.3 不同脱脂剂的本身特性及脱脂效果

不同脱脂试剂的选择均以最大程度析出骨体内的油脂成分，且尽可能不损伤骨骼本身为标准。吴坤成等[14]的研究表明，工业环己酮、工业乙酸乙酯、工业丙酮、天那水等试剂具备较好的脱脂效果，但均存在易燃、刺激性强等问题，且工业环己酮为3类致癌物，存在致癌的风险。

本研究选用4种脱脂试剂：脂肪酶、丙酮、氢氧化钠、氢氧化钾，在不同的时间段观察其对骨骼的影响，作用效果也不同。有机溶剂丙酮是一种易溶于水且溶解度高的试剂，制作时利用丙酮对脂肪萃取的作用可实现分离骨组织与脂肪的目的[15]。由于丙酮对骨骼自身无影响，经浸泡脱脂后的骨骼完整性、硬度均无较大变化，油脂析出量符合脱脂标准，但丙酮存在刺激性强、气味重的缺点。

氢氧化钠与氢氧化钾属于强碱类物质，可与甘油三酯等油脂类物质发生皂化反应，使油脂水解脱出，但易腐蚀骨骼，损伤其完整性。经浸泡脱脂后虽油脂析出量符合标准，但骨骼本身完整度与硬度明显下降。

脂肪酶是一种羟基酯水解酶类物质，脂肪酶所具有油-水界面的亲和力，能够在油-水界面上高速率地催化水解不溶于水的脂类物质。本研究表明，脂肪酶具有与丙酮脱脂相似的优点，即浸泡脱脂后的骨骼完整性、硬度均无较大变化，同时脂肪酶还具备丙酮不具备的安全绿色的优点。近年来，也有研究表明，十二烷基苯磺酸钠（C18H29NaO3S，简称LAS）对犬骨骼的脱脂效果良好[4]，是一种高效、低毒环保的优质脱脂剂。但与本研究使用的脂肪酶相比，LAS对皮肤具有一定的刺激性[16]。

3.4 脱脂试剂安全性分析

本研究中选用的丙酮属于有毒且易燃的危险品。在漂白过程中，选择过氧化氢作为漂白剂时，若清洗不到位，残留的漂白剂极易与丙酮发生爆炸反应。氢氧化钠、氢氧化钾均属于强碱类物质，具有强腐蚀性，易对骨骼产生不同程度的影响。因此，碱性试剂的使用的浓度和浸泡时间均要求严格控制。本研究中选用的脂肪酶兼具脱脂效果较好、实惠易得、安全系数高等优点。

3.5 环境等外界因素对结果的影响

本试验时间为冬季，导致溶剂作用时间变缓，且制作溶液时较为不便。此外，溶液的作用效果也受到光照、空气流通等因素的影响。丙酮等试剂极易挥发，影响试验效果。脂肪酶的脱脂程度也会受到温度的影响，在不适的温度下无法最大程度上发挥脂肪酶的脱脂效果。因此，在使用脱脂酶的过程中应注意环境的温度，避免由此导致脱脂的效果不佳。

4 结论

本试验结果表明，脂肪酶脱脂的骨骼经漂白后在骨骼硬度、完整度、洁白度等方面均优于其他脱脂试剂。此外，脂肪酶还具有安全稳定、无污染等特点，是一种安全性、实用性、经济性俱佳的骨骼脱脂剂。