基于分子对接及实验验证探讨骨碎补总黄酮与脂肪因子结合防治绝经后骨质疏松症的作 用 机 制*

吴睿哲，吴 洁，刘 凯，葛殊玮，伍 强，王 凡，曾景奇

（1.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005；2.宁乡市中医院，湖南 宁乡410601）

绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一种女性绝经后性激素分泌缺乏导致成骨-破骨平衡被打破，出现骨吸收大于骨形成最终导致以骨量减少、骨密度（bone mineral density，BMD）降低、骨组织微环境及微结构改变为特征的常见原发性疾病。随着雌激素分泌的骤然变化，部分女性绝经后出现脂代谢功能的紊乱，极易出现体质量指数（body mass index，BMI）的变化。有研究证明，BMI与BMD存在正相关性[1]，并被证实具有抑制骨质疏松（osteoporosis，OP）进展的作用，且有研究者认为机械性的应力刺激可增强骨重塑过程从而对抗BMI的增加[2]。随着细胞分子层面上研究的深入，脂肪组织不再被认为是一种单纯的储能与供能组织；脂肪组织具有旁分泌、自分泌、免疫活性等功能，脂肪因子（adipokine）作为脂肪细胞分泌的多种信号分子已被证实能通过成骨-成脂平衡影响骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）的分化。瘦素（leptin，LEP）、脂联素（adiponectin，ADP）是脂肪因子家族的重要成员，两者及其相应受体参与了调控成骨细胞的成骨-破骨平衡[3]。

近年来，对补肾类中药防治骨质疏松症机制作用研究取得了一定的成果[4]，其中补肾类代表药物骨碎补在防治OP、骨组织重建修复等方面的作用逐渐引起众多学者的关注。骨碎补有效成分骨碎补总黄酮的成分复杂，与脂肪因子作用防治PMOP的研究较少，故本研究通过分子对接对骨碎补总黄酮含有的多个主要活性成分与ADP、LEP的结合可能性进行预估，并通过动物实验探讨骨碎补总黄酮对绝经后骨质疏松症大鼠血清ADP、血清LEP及BMD的影响，旨在为骨碎补防治PMOP的具体作用机制研究提供思路，并为临床推广提供依据。

1 材料与方法

1.1 分子对接

1.1.1 骨碎补总黄酮有效成分筛选 在中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，https://tcmsp-e.com/）中以“骨碎补”作为关键词，进行药物有效化学成分的筛选。根据ADME原则选取满足口服生物利用度（oral bioavailibility，OB）≥30%及类药性（drug-likeness，DL）≥0.18的化学成分，并通过分子结构筛选出有效成分中的黄酮类成分。

1.1.2 活性成分与核心靶点的分子对接 选取骨碎补总黄酮中关键成分与LEP、ADP进行分子对接。在RCSB PDB数据库（https://www1.rcsb.org/）中下载LEP（PDB-ID：1AX8）及ADP（PDB-ID：6U66）的pdb格式结构文件；根据筛选结果在ZINC小分子数据库（https://zinc.docking.org/）中下载骨碎补总黄酮关键成分的mol2格式结构文件。运用AutoDockTools1.5.6对骨碎补总黄酮关键成分与LEP、ADP进行分子对接，并用Pymol2.4.0对分子对接结果进行可视化呈现。

1.2 动物实验

1.2.1 实验动物6个月龄SPF级雌性、健康、成年、未孕SD大鼠40只，体质量（400±20）g，由湖南中医药大学动物实验中心统一购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004。动物使用许可证号：SYXK（湘）2019-0009。在湖南中医药大学SPF级实验室中进行实验操作，饲养环境：温度（22±2）℃，湿度（65±5）%，光照/黑暗12 h交替，自由饮食。取材时将大鼠麻醉处死。本实验经湖南中医药大学实验动物伦理委员会审核批准，批准编号：LL2020092504，实验过程中参照国家《关于善待实验动物的指导性意见》对大鼠进行处置，并按照4R原则给予人道关怀。

1.2.2 药物与试剂 阿仑膦酸钠片（商品名：福善美，规格：7 mg/粒，批号：20190611）购自杭州默沙东制药有限公司；骨碎补总黄酮[商品名：强骨胶囊，规格：0.25 g/粒，其中有效成分（骨碎补总黄酮）约为0.18 g，批号：191011]购自北京岐黄制药有限公司；LEP ELISA试剂盒（批号：E16036967）、ADP ELISA试剂盒（批号：D17036968）均购自武汉华美生物工程有限公司；雌二醇（E2）ELISA试剂盒（批号：501890）购自美国Cayman公司。

1.2.3 主要仪器H1650R型台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；PW-812型全自动酶标洗板机（深圳市汇松科技发展有限公司）；MB-530型多功能酶标分析仪（深圳市汇松科技发展有限公司）；DHP-500型电热恒温培养箱（北京市永光明医疗仪器有限公司）；HNCDC/CZG-10-103型骨密度仪（美国Hologic Discovery）。

1.2.4 分组与造模 将大鼠按照随机数字表法分为空白组、模型组、中药组、西药组，每组10只。造模参考文献[5]，采用背侧入路行双侧卵巢摘除手术以建立绝经后骨质疏松症模型，10%水合氯醛（3 mL/kg）行腹腔麻醉，麻醉满意后俯卧位固定大鼠，背侧骶尾部至肋骨下缘备皮消毒，取背侧肋缘下正中1.5 cm为中点做一长约1.5 cm纵行切口至皮下，牵拉切口左移1 cm垂直钝性分离皮下肌肉组织显露腹腔，可见大量白色脂肪组织，小心提拉探查脂肪组织，可见淡红色桑葚状卵巢组织及相连的输卵管，3-0外科缝线环状结扎卵巢与输卵管连接处后，使用组织剪剪除卵巢，将剩余组织回纳至腹腔并缝合肌肉组织，牵拉切口至中点右侧1 cm，同前切除右侧卵巢组织，逐层缝合术口，络合碘二次消毒。空白组大鼠找到卵巢后，将卵巢从腹腔提出而不切除，仅切除周围少量脂肪组织，术前0.5 h和术后3 d给予青霉素G钠盐5万单位肌内注射，预防感染。

1.2.5 实验给药 造模2个月后，造模组大鼠骨密度明显低于对照组则提示骨质疏松症模型制备成功[5]，开始对各组大鼠灌胃给药，给药体积均为10 mL/kg。中药组（骨碎补总黄酮）与西药组（阿仑膦酸钠）通过人与动物体表面积比值换算出等效用药剂量，所用药物以蒸馏水定容至所需浓度。中药组按照25 mg/kg剂量灌胃给药，1次/d；西药组按照4 mg/kg剂量灌胃给药，1次/周；对照组、模型组大鼠灌胃给予等体积蒸馏水。连续灌胃12周。

1.2.6 观察指标

1.2.6.1 标本采集 给药12周后，最后一次灌胃2 h后腹腔麻醉，腹主动脉采血4 mL，3000 r/min离心15 min，分离血清后分装至-80℃冰箱中保存；脱颈椎处死各组大鼠，完整分离出左侧股骨，小心剔除肌肉组织后，放入-80℃冰箱中保存，备用。

1.2.6.2 BMD检测 取出备用的股骨，仔细剔除附着的肌肉软组织，生理盐水冲洗，双能X线骨密度仪测定各组大鼠离体左侧股骨骨密度。

1.2.6.3 E2、LEP、ADP含量检测ELISA法分别检测各组大鼠血清中的E2、LEP、ADP含量，严格按试剂盒说明书要求进行操作。1.3统计学方法 使用SPSS 23.0对实验数据进行统计分析，计量资料以“均数±标准差”（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义，使用GraphPad Prism 7.0进行数据可视化呈现。

2 结果

2.1 骨碎补总黄酮有效成分筛选 使用“骨碎补”作为关键词在TCMSP数据库进行检索，获得71种主要成分信息，使用ADME原则进行二次筛选后满足OB值≥30%，DL值≥0.18的有效成分有18种，其中骨碎补黄酮类有效成分共10种。（见表1）

表1 骨碎补总黄酮有效成分信息表

2.2 分子对接结果及呈现 为进一步评价骨碎补总黄酮有效成分与ADP、LEP的亲和能力，使用AutodockTools对筛选出的有效成分及目标靶点进行分子对接计算，对接结果见表2。根据DENNIS等[6]研究报道，结合能≤-4.0 kcal/mol表明分子与靶点具有一定的结合活性，结合能≤-5.0 kcal/mol表明分子与靶点具有良好的结合活性，结合能≤-7.0 kcal/mol表明分子与靶点具有明显结合活性，故选用结合能≤-5.0kcal/mol作为结合有效指标。结果显示，骨碎补总黄酮与LEP结合能≤-5.0kcal/mol的有效成分有6种，占总数的60%；与LEP结合能≤-5.0 kcal/mol的有效成分有8种，占总数的80%。采用Pymol2.4.0对有效成分与LEP、ADP对接结合能绝对值排名前三的结果进行可视化呈现，结果见图1。

图1 有效成分与靶点蛋白对接结果可视化呈现

2.3 各组大鼠BMD比较 与空白组比较，模型组大鼠BMD明显降低（P<0.05）；与模型组比较，中药组、西药组大鼠BMD明显升高（P<0.05），且中药组大鼠BMD与西药组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。（见图2）

图2 各组大鼠骨密度（BMD）比较（±s，n=10）

2.4 各组大鼠血清E2、ADP、LEP水平比较 与空白组比较，模型组大鼠血清E2、ADP、LEP水平均明显降低（P<0.01）。与模型组比较，西药组大鼠血清E2、LEP水平均明显升高（P<0.01），而西药组大鼠血清ADP水平与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；中药组大鼠血清E2水平明显升高（P<0.01），ADP水平明显降低（P<0.01），而中药组大鼠血清LEP水平与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。与西药组比较，中药组大鼠血清E2、LEP、ADP水平均明显降低（P<0.01）。（见图3）

图3 各组大鼠血清E2、ADP、LEP水平比较（±s，n=10）

3 讨论

中医学认为绝经后骨质疏松症属“骨痿”范畴，病位位于肾、脾二脏。绝经后骨质疏松症的发生主要与肾虚和血瘀有关，其中肾虚是本病的主要原因。骨碎补是补肾药的代表之一。骨碎补性温，味苦，归肝、肾经，具有补肾、壮骨、强筋、活血的功能。骨碎补总黄酮为其主要成分。课题组前期研究[7-8]证实，骨碎补总黄酮可通过升高BMP-2、Bcl-2、IGF-1等细胞因子的表达，延缓失用性骨质疏松症模型大鼠BMD的降低。

成骨细胞与破骨细胞之间的动态平衡变化一直是研究骨组织新生修复、维持骨量的关键，两种细胞分别来自BMSC及造血干细胞的分化[9]，同时BMSC也可以分化出脂肪细胞，随之也伴随着BMSC的成骨-成脂分化竞争机制。研究[10]显示，脂肪细胞分泌的脂肪因子不仅可以参与调节成骨分化，还可以通过影响相关转录因子的表达，参与破骨细胞分化的启动、分化进程，提示脂肪因子很可能通过多种途径参与成骨-破骨平衡的调节。ADP是由脂肪细胞分泌的一种特异性蛋白，在成骨、破骨细胞表面均检测到其相应的两种受体ADP受体1和ADP受体2。而目前ADP对成骨细胞及破骨细胞增殖、分化、活性、功能的影响研究尚无统一定论，富集在骨骼局部的ADP和游离在外周血中的ADP对成骨、破骨细胞的影响也具有差异性[11]。早期研究发现ADP能通过影响OPG/RANK/RANKL信号通路的表达间接促进破骨细胞的分化及功能，同时能通过MAPK信号通路诱导成骨细胞的增殖和分化，影响成骨-破骨平衡的稳定，最终导致骨量的流失[12]。有学者通过分析临床观察数据后提出血清ADP水平升高与骨密度成负相关，而降低ADP的表达对降低PMOP的发生率有着积极作用[13]。动物实验研究[14]证实，通过ADP受体抑制剂干预的小鼠骨骼再生速度更快，而脂肪生成速度减缓；敲除ADP基因小鼠的骨密度升高，骨组织内骨小梁数目增多，体内破骨细胞数量减少[10]，这与本次研究的结果一致。而重组ADP对ADP缺乏模型小鼠进行干预后，RANKL/OPG比值降低，破骨细胞分化数量减少[15]，值得注意的是，局部ADP的升高可以抑制成骨细胞的分化，导致骨密度降低[16]。LEP是一种由167个氨基酸组成的分泌型蛋白质，主要由白色脂肪组织产生。此外，骨髓中的脂肪组织也可以产生LEP。LEP是肥胖基因（Ob）的表达产物，在成骨、破骨细胞表面同样可以检测到其受体[17]。LEP可通过中枢和外周两种途径影响骨代谢：在外周，LEP一方面抑制脂肪细胞的形成并促进成骨细胞的分化，另一方面通过激活OPG/RANK/RANKL信号通路升高骨保护素（Osteoprotegerin，OPG）含量，进而抑制破骨细胞的产生，最终对成骨-破骨平衡起到正向调节作用；在中枢，LEP通过兴奋交感神经、促进去甲肾上腺素的释放、增加RANKL的表达来促进破骨细胞的增殖分化，最终达到抑制骨形成的作用[18-21]。LIU X L等[22]在追赶生长（Catch-up growth，CUG）模型动物实验中观察到高脂饮食导致了骨量的严重减少，LEP的不足更是加重了骨量的丢失，且骨组织形态学上发生了严重病理变化。

分子对接计算结果显示，骨碎补总黄酮中部分成分可以与ADP、LEP进行对接，且与ADP的结合活性相对较好。其中骨碎补苷A（Davallioside A_qt）与ADP结合能≤-7.0 kcal/mol，表明这一成分很可能是骨碎补总黄酮与ADP作用的主要成分。动物实验中，经骨碎补总黄酮与阿仑膦酸钠片干预的去势大鼠BMD及E2的表达均高于模型组，但在对ADP和LEP的作用上表现出相反的结果。研究发现，多种补肾中药复方可以通过抑制LEP启动子的甲基化从而提高LEP的表达量以防治OP[23]，但在本次研究中并未观察到LEP含量的上升，这可能与LEP主要在成骨细胞矿化期分泌合成而在成骨细胞成熟后消失有关[24]。本次分子对接结果及动物实验结果显示，在PMOP疾病进程中，大鼠血清ADP、LEP水平均明显降低；骨碎补总黄酮可能通过改善E2分泌、降低ADP的表达，延缓BMD的流失来防治PMOP，但相关的机制仍需进一步进行探究。