多糖类肝素湿品沉淀可保存时长的研究

田志鹏，杜曦*，王亮，兰舫，张灿（.河北常山生化药业股份有限公司，石家庄 050800；2.河北省多糖类药物工程技术研究中心，石家庄 050800）

肝素钠，作为一种抗凝血、抗血栓的药物已存在百年之久，其中低分子肝素作为抗凝血剂，是最常用于血栓栓塞的预防和治疗药物。2020年世界卫生组织在“疑似新型冠状病毒感染时针对严重急性呼吸道感染的临床处理临时指导”中曾建议，可通过给予肝素以预防新型冠状病毒肺炎患者的静脉血栓栓塞。2022年最新的研究表明使用高于预防剂量的依诺肝素治疗新型冠状病毒肺炎患者，可将其住院时间缩短20%以上，缓解超过65%病例的症状。

肝素的粗品通常来源于猪肠黏膜（牛源和羊源肝素与猪源肝素同样有着类似的理化性质和结构）。肝素粗品经过盐解，热变性，提纯，氧化得到肝素钠精品。肝素平均分子量约16 000道尔顿（Da），并且有相似的抗Ⅹa与抗Ⅱa因子活性。低分子量肝素（LMWH）重均分子量通常在8000以下，小于8000的级分不少于60%，且抗Ⅹa因子大于抗Ⅱa因子活性。两者皆通过结合ATⅢ抑制凝血酶的活性，达到抗凝血、抗血栓的作用。

目前对于肝素类原料产品的保存方式仅限于固体干燥粉末，且需要密封置于阴凉，干燥处存放。而将肝素钠、达肝素钠、依诺肝素钠以溶液状态存放，存在染菌风险，随着时间的延长，产品会有一个自然分解过程，重均分子量逐渐变低，低分子组分逐渐增多。本文用到的肝素钠及两种代表性低分子量肝素产品（达肝素钠、依诺肝素钠）均为我公司自制。达肝素钠为亚硝酸降解法制备，依诺肝素钠为

β

-消除降解法制备。通过将多糖类肝素产品从其溶液中分离，加乙醇进行液封保存，并将此法长期保存的样品与干燥粉末的分子量、效价、双糖进行对比，考察肝素产品的质量变化，以提供一种新的保存方式和可存放的时限，解决企业生产过程中遇到的产品因滞留和冻干设备故障中间产品无法保存的问题。

1 材料

1.1 试药

肝素钠、达肝素钠、依诺肝素钠（原料药，河北常山生化药业股份有限公司）；依诺肝素钠对照品（批号：6.0，欧洲药品质量管理局EDQM）；氯化钠（河北华晨药业）；乙醇（梅河口市阜康酒精有限公司）；醋酸铵、亚硝酸钠、三羟甲基氨基甲烷、硫酸、氢氧化钾（分析纯，天津永大化学试剂有限公司）；乙二胺四乙酸二钠、硫酸钠、磷酸二氢钾、醋酸钙（分析纯）、牛血清白蛋白（含量≥98%，Vetec Sigma-Aldrich）；硝酸锂（分析纯，Aladdin试剂）；抗凝血酶ATⅢ、FⅩa因子、发色底物S-2765，发色底物S-2238（意大利Chromogenix）；乙腈（色谱纯，美国Merck）；肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（含量＞99%，北京艾德豪克）。

1.2 仪器

OS20-S数显顶置电子搅拌器（大龙兴创实验仪器）；FE28型pH计、PL602-L电子天平（Mettler Toledo）；DZF-6210真空干燥箱（上海一恒）；U3000高效液相色谱仪（美国Thermo Scientific）；2414示差折光检测器（美国Waters）；384 DMS酶标仪（美国美谷分子仪器）；S2型96孔通道紫外检测器（上海美杏高德生物）；色谱柱（Waters Xbridge Beh 200A Sec，Waters Spherisorb Sax）；UV-8000紫外可见分光光度计（上海元析仪器）。

2 方法

2.1 试验步骤

分别取一定量肝素钠、达肝素钠、依诺肝素钠样品，加入纯化水搅拌溶解（1∶10以内），并补加溶液体积1%的氯化钠，以模拟生产过程中产品溶液状态。加入4倍以上95%乙醇进行搅拌沉淀，边加入边快速搅拌。加入完毕继续搅拌15 min，随后静置8 h以上，分离底部沉淀并将上清溶液除尽。沉淀使用少量乙醇进行液封保证完全隔离空气，置于15～25℃保存。分别于第10日、20日、30日、3个月、6个月、9个月、12个月取样，检测分子量、效价、双糖。

2.2 检测方法

2.2.1 分子量及效价 肝素钠分子量、效价检测方法参照《中国药典》2020年版；达肝素钠及依诺肝素钠分子量、效价检测方法参照欧洲药典EP10.5并进行优化。

2.2.2 双糖 依诺肝素钠双糖检测方法参考欧洲药典EP 10.5：

① 色谱条件：流动相A为磷酸二氢钠溶液（取磷酸二氢钠0.280 g，加水950 mL使溶解，用磷酸调节pH值至3.0，加水稀释至1000 mL），流动相B为高氯酸钠磷酸二氢钠溶液（取高氯酸钠140 g，加流动相A 950 mL使溶解，用磷酸调节pH值至3.0，用流动相A稀释至1000 mL）；柱温：50℃；流速：0.8 mL·min；进样量：10 μL；检测器：紫外检测器，检测波长：234 nm。

② 溶液配制

肝素酶溶液：取肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ适量，分别加pH 7.0磷酸钾缓冲液制成0.4 IU·mL的溶液。将其按1∶1∶1的体积比混合，得到混合肝素酶溶液。

供试品溶液（酶解）：取供试品适量，加水制成20 mg·mL的溶液，取20 μL，加入pH 7.0醋酸钙溶液70 μL和肝素酶混合液100 μL混匀，置25℃恒温环境中放置48 h以上。

对照品溶液（酶解）：取对照品适量，加水制成20 mg·mL的溶液，取20 μL，加入pH 7.0醋酸钙溶液70 μL和肝素酶混合液100 μL混匀，置25℃恒温环境中放置48 h以上。

空白溶液：取水20 μL，与供试品溶液同时同法进行酶解，作为空白溶液。

取空白溶液、供试品溶液（酶解）、对照品溶液（酶解）各10 μL，注入液相色谱仪，进行测定。

肝素钠、达肝素钠双糖检测方法参考依诺肝素钠双糖检测方法。

3 结果与讨论

3.1 肝素钠检测结果

3.1.1 肝素钠分子量结果 肝素钠分子量检测结果见表1，根据《中国药典》2020版肝素钠分子量与分布检测描述，重均分子量应在标示值±500范围内，肝素钠长期的检测结果

RSD

为0.50%，可认为分子量未发生较大波动，测量结果有较高准确度。肝素钠以本文方式存放，分子量12个月内不会发生变化。

表1 肝素钠分子量及分布检测结果
Tab 1 Molecular weight and distribution of heparin sodium

肝素钠 重均分子量 ＞24 000/%干品 17 133 14.6保存10日 17 112 14.2保存20日 17 187 14.5保存30日 17 109 14.0保存3个月 17 123 15.0保存6个月 17 128 14.3保存9个月 17 148 14.3保存12个月 16 919 14.1平均值 17 104 14.3 RSD/% 0.50 2.3

3.1.2 肝素钠效价结果 肝素钠效价检测结果见表2，肝素钠的效价检测属于生化药品的检测范围，存在较大的波动，根据《中国药典》2020版肝素钠生物测定法描述，我们把效价的

RSD

值＜5.0%认为样品稳定未发生较大变化。肝素钠长期存放后的效价检测结果

RSD

值为1.6%，可认为肝素钠以本文方式保存12个月，效价不会发生变化。

表2 肝素钠效价检测结果
Tab 2 Heparin sodium potency

肝素钠 抗Ⅱa因子效价/（IU·mg－1）干品 218.4保存10日 225.7保存20日 219.2保存30日 219.8保存3个月 227.2保存6个月 225.0保存9个月 227.5保存12个月 221.0平均值 223.6 RSD/% 1.6

3.1.3 肝素钠双糖结果 肝素钠双糖检测结果见表3。肝素钠的双糖重复单元由己糖醛酸（HexA）和葡萄糖胺（GlcN）组成。己糖醛酸（HexA）包括

β

-

D

-葡萄糖醛酸（GlcA）和

α

-

L

-艾杜糖醛酸（IdoA），可以发生2-

O

-硫酸基（2S）取代。葡萄糖胺（GlcN）可发生

N

-乙酰化（GlcNAc）、

N

-硫酸化（GlcNS），3-

O

-硫酸化（3S）和6-

O

-硫酸化（6S）修饰。生化药品由于其本身的特殊性、双糖检测的复杂性，以及受肝素酶的裂解程度差异等因素的影响较大，易存在较大的分析方法检测误差。通过肝素酶Ⅰ、Ⅱ 和Ⅲ 的联合酶解可将肝素钠完全降解为二糖基本组成单元，其中糖醛酸变为不饱和糖醛酸（∆UA）。我们把含量较少的糖醛酸2-

O

脱硫酸翻转产物△ⅣSgal、△ⅡSgal（含量不足1%）认为存在即可。

RSD

值不大于10%，认为样品双糖结构未发生较大变化。由表3肝素钠双糖检测结果可知，8种基础二糖组成单元△ⅣA（∆UA-GlcNA）、△ⅣS（∆UA-GlcNS）、△ⅡA（∆UA-GlcNAc6S）、 △ⅢA（∆UA2S-GlcNAc）、△ⅡS（∆UA-GlcNS6S）、△ⅢS（∆UA2S-GlcNS）、△ⅠA（∆UA2S-GlcNAc6S）、△ⅠS（∆UA2SGlcNS6S），丝氨酸氧化1形态△Glyserox1，其检测结果

RSD

值均＜10%，可认为其结构组成均未发生明显变化。即肝素钠以本文方式保存12个月，双糖结构不会发生变化。

表3 肝素钠双糖检测结果
Tab 3 Heparin sodium disaccharide

肝素钠 △ⅣA △Glyserox1 △ⅣSgal △ⅣS △ⅡA △ⅢA △ⅡSgal △ⅡS △ⅢS △ⅠA △ⅠS干品 3.77 1.64 0.07 3.05 3.40 1.74 0.52 10.71 7.12 1.51 61.86保存10日 3.68 1.61 0.10 3.19 3.44 1.81 0.54 10.79 7.09 1.51 62.04保存20日 3.70 1.62 0.07 3.12 3.45 1.76 0.53 10.87 7.10 1.51 62.15保存30日 3.37 1.56 0.11 2.79 3.03 1.63 0.61 10.04 6.87 1.49 63.31保存3个月 3.40 1.51 0.09 2.82 3.12 1.62 0.54 10.06 7.30 1.52 62.87保存6个月 3.24 1.45 0.07 2.79 3.12 1.56 0.46 10.68 7.33 1.49 63.65保存9个月 3.66 1.51 0.08 3.10 3.63 1.80 0.69 10.91 7.11 1.56 62.87保存12个月 3.84 1.54 0.07 3.10 3.60 1.79 0.66 10.91 7.11 1.54 62.96平均值 3.56 1.54 － 2.99 3.34 1.71 － 10.61 7.13 1.52 62.84 RSD/% 6.1 3.9 －6.07.46.0－ 3.72.11.7 0.92

3.2 达肝素钠检测结果

3.2.1 达肝素钠分子量结果 达肝素钠分子量检测结果见表4，我国对达肝素，依诺肝素这两种低分子肝素品种暂未收录，低分子量肝素的分子量测定误差较大，对其分子量及分布的检测测定值应在标示值±3.3%，达肝素钠重均分子量应在标示值±200。达肝素钠长期的检测结果

RSD

为1.0%，可认为分子量未发生较大波动，测量结果有较高准确度。达肝素钠以本文方式存放12个月，分子量不会发生变化。

表4 达肝素钠分子量及分布检测结果
Tab 4 Molecular weight and distribution of dalteparin sodium

达肝素钠 重均分子量 ＜3000/% ＞8000/%干品 6189 11.0 22.0保存10日 6064 10.9 21.7保存20日 6131 10.8 22.5保存30日 6210 10.3 22.7保存3个月 6239 10.1 23.3保存6个月 6126 10.5 23.0保存9个月 6156 10.2 22.3保存12个月 6189 10.0 22.7平均值 6159 10.4 22.6 RSD/% 1.0 3.3 2.3

3.2.2 达肝素钠效价结果 达肝素钠效价检测结果见表5，达肝素钠的效价检测属于生化药品的检测范围，存在较大的波动，所以我们定义效价的

RSD

值＜5.0%认为样品是稳定未发生较大变化的。根据达肝素钠长期的效价检测结果，其抗Ⅹa因子效价，抗Ⅱa因子效价，抗Ⅹa∶抗Ⅱa因子

RSD

值分别为2.0%、2.9%、2.6%。认为达肝素钠长期以本文方式保存，效价12个月内不会发生变化。

表5 达肝素钠效价检测结果
Tab 5 Dalteparin sodium potency

达肝素钠 抗Ⅹa因子/（IU·mg－1）抗Ⅱa因子/（IU·mg－1） 抗Ⅹa∶抗Ⅱa干品 135.1 62.2 2.2保存10日 134.2 61.1 2.2保存20日 133.4 62.1 2.1保存30日 134.1 61.3 2.2保存3个月 133.1 61.0 2.2保存6个月 131.2 60.4 2.2保存9个月 127.4 59.1 2.2保存12个月 129.1 57.0 2.3平均值 131.8 60.3 2.2 RSD/% 2.0 2.9 2.6

3.2.3 达肝素钠双糖结果 达肝素钠双糖检测结果见表6。达肝素钠非还原端（NRE）的主要结构为2-

O

-硫酸-

α

-

L

-艾杜糖醛酸，还原端主要结构为6-

O

-硫酸-2，5-内醚-

D

-甘露糖醇。使用肝素酶Ⅰ、Ⅱ 和Ⅲ 的联合降解可将达肝素完全酶解为二糖基本组成单元。我们把含量较少的来源于肝素和蛋白质连接域的寡糖结构△Glyserox1，糖醛酸2-

O

脱硫酸翻转产物△ⅣSgal（含量不足1%）认为存在即可。其他组分

RSD

值不大于10%，我们认为样品双糖结构未发生较大变化。由表6达肝素钠长期的双糖检测结果，主峰糖结构△ⅡA-ⅣSglu＋ⅠS；8种基础二糖组成单元△ⅣA、△ⅣS、△ⅡA、△ⅢA、△ⅡS、△ⅢS、△ⅠA、△ⅠS，特征双糖△ⅡM、△ⅠM，特征四糖△ⅠS-ⅠM；糖醛酸2-O脱硫酸翻转产物△ⅡSgal检测结果

RSD

值均＜10%，可认为其结构组成均未发生变化。所以达肝素钠以本文方式保存12个月，双糖结构不会发生变化。

表6 达肝素钠双糖检测结果
Tab 6 Dalteparin sodium disaccharide

达肝素钠 △ⅣA△Glyserox1 △ⅣSgal△ⅣS△ⅡM△ⅡA△ⅢA△ⅡSgal△ⅡS△ⅢS△ⅠM△ⅠA△ⅡA-ⅣSglu＋ⅠS△ⅡA-ⅡSglu△ⅠS-ⅠM干品 2.01 0.56 0.20 1.65 1.99 3.38 1.24 2.64 8.05 4.48 1.01 1.47 57.41 3.11 6.48保存10日 1.70 0.47 0.21 1.36 2.06 3.19 1.17 2.62 8.10 4.25 0.92 1.41 57.35 3.35 6.74保存20日 1.87 0.54 0.24 1.51 2.13 3.50 1.24 2.60 8.38 4.39 0.96 1.47 56.31 3.41 6.56保存30日 2.13 0.58 0.20 1.64 1.95 3.21 1.21 2.43 7.57 4.32 1.11 1.59 58.88 3.24 6.09保存3个月 1.94 0.49 0.21 1.68 1.96 3.35 1.33 2.65 7.88 4.11 1.10 1.54 57.74 3.43 5.81保存6个月 1.96 0.58 0.22 1.48 1.93 3.05 1.18 2.94 7.99 3.93 1.13 1.52 57.57 3.72 5.99保存9个月 2.27 0.76 0.10 1.60 1.69 3.45 1.49 2.96 7.74 4.54 1.07 1.55 56.88 3.01 5.59保存12个月 2.02 0.51 0.23 1.58 1.74 3.35 1.3 2.38 8.09 4.31 1.07 1.53 55.81 3.28 5.58平均值 1.98 － － 1.55 1.92 3.30 1.27 2.65 7.96 4.26 1.05 1.52 57.22 3.35 6.05 RSD/% 9.2－ －7.08.34.88.88.53.34.67.63.91.86.57.5

3.3 依诺肝素钠检测结果

3.3.1 依诺肝素钠分子量结果 依诺肝素钠分子量检测结果见表7，依诺肝素钠重均分子量应在标示值±150范围内，而依诺肝素钠长期的分子量及分布检测结果

RSD

＜1.2%，我们认为分子量未发生较大波动，测量结果有较高准确度。依诺肝素钠以本文方式存放12个月，分子量不会发生变化。

表7 依诺肝素钠分子量及分布检测结果
Tab 7 Molecular weight and distribution of enoxaparin sodium

依诺肝素钠 重均分子量 ＜2000/%2000～8000/%＞8000/%干品 4410 16.4 72.8 10.8保存10日 4440 16.4 72.5 11.1保存20日 4411 16.6 72.5 10.8保存30日 4428 16.4 72.7 10.9保存3个月 4436 16.5 72.5 11.0保存6个月 4464 16.2 72.6 11.2保存9个月 4437 16.3 72.7 11.0保存12个月 4451 16.3 72.6 11.1平均值 4438 16.4 72.6 11.0 RSD/% 0.40 0.80 0.10 1.2

3.3.2 依诺肝素钠效价结果 依诺肝素钠效价检测结果见表8，依诺肝素钠的效价检测属于生化药品的检测范围，存在较大的波动，所以我们定义效价的

RSD

值＜5.0%认为样品是稳定的。根据依诺肝素钠长期的效价检测结果，其抗Ⅹa因子效价，抗Ⅱa因子效价，抗Ⅹa∶抗Ⅱa因子

RSD

值分别为1.0%、1.3%、0.0%。我们认为依诺肝素钠以本文方式保存12个月，效价不会发生变化。

表8 依诺肝素钠效价检测结果
Tab 8 Enoxaparin sodium potency

3.3.3 依诺肝素钠双糖结果 依诺肝素钠双糖检测结果见表9。肝素酶Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ联合酶切依诺肝素钠的1，4-糖苷键，并在二糖和寡糖的NRE处留下不饱和的Δ4，5-糖醛酸残基（△UA）。但是其中一些特殊结构，如GlcN残基上的3-

O

-磺基和1，6-脱水衍生物，可能会阻碍肝素酶的活性使其生成不饱和四糖而不是二糖。除依诺肝素钠的原始NRE和RE以外，其大多数结构特征均可从酶解产物中推导出。我们把含量较少的糖醛酸2-

O

脱硫酸翻转产物△ⅣSgal，丝氨酸氧化1形态△Glyserox1，四糖△ⅡA-ⅣSglu（含量不足1%）认为存在即可，其余组分

RSD

值不大于10%，认为样品双糖结构未发生较大变化。由表9依诺肝素钠长期的双糖检测结果可知，8种基础二糖组成单元△ⅣA、△ⅣS、△ⅡA、△ⅢA、△ⅡS、△ⅢS、△ⅠA、△ⅠS，含1.6结构组分△ⅠS（1，6），△ⅠS-ⅠSid（1，6），三糖结构△ⅠS-ⅠdoA2S，四糖结构△ⅡA-ⅡSglu，糖醛酸2-

O-

脱硫酸翻转产物△ⅡSgal检测结果

RSD

值均＜10%，认为结构组成均未发生变化。所以依诺肝素钠以本文方式常温保存12个月，双糖结构不会发生变化。

表9 依诺肝素钠双糖检测结果
Tab 9 Enoxaparin sodium disaccharide

依诺肝素钠△ⅣA△Glyserox1△ⅣSgal△ⅣS△ⅡA△ⅢA △ⅡSgal △ⅡS△ⅢS△ⅠS（1，6）△ⅠA△ⅡA-ⅣSglu△ⅠS△ⅡA-ⅡSglu△ⅠS-ⅠdoA2S△ⅠS-Ⅰsid（1.6）干品 2.27 0.45 0.36 3.05 3.81 1.88 1.35 10.61 6.72 1.36 1.53 0.42 59.45 2.22 1.05 1.18保存10日 2.43 0.39 0.29 2.76 3.58 1.57 1.29 9.80 6.82 1.24 1.56 0.46 62.38 2.49 1.01 1.20保存20日 2.26 0.41 0.34 2.81 3.79 1.82 1.23 10.18 6.30 1.32 1.56 0.45 62.23 2.48 1.02 1.06保存30日 2.42 0.41 0.33 2.65 3.76 1.64 1.49 10.60 6.89 1.37 1.56 0.53 60.83 2.42 1.12 1.29保存3个月 2.33 0.42 0.34 2.72 3.76 1.69 1.37 9.90 6.50 1.37 1.57 0.50 61.23 2.46 1.18 1.41保存6个月 2.24 0.40 0.34 2.70 3.42 1.81 1.26 10.02 6.83 1.32 1.63 0.51 62.18 2.48 1.08 1.28保存9个月 2.19 0.42 0.22 2.70 3.81 1.61 1.29 10.04 6.49 1.31 1.72 0.46 62.94 2.45 0.99 1.30保存12个月 2.13 0.10 0.28 2.60 3.35 1.59 1.45 10.78 6.94 1.39 1.58 0.52 61.98 2.49 1.24 1.11平均值 2.29 － － 2.71 3.64 1.68 1.34 10.19 6.68 1.33 1.60 － 61.97 2.47 1.09 1.24 RSD/% 5.0－－2.55.26.17.4 3.63.73.83.7－1.21.08.6 9.8

4 结论

本文提供了一种新的多糖类药物保存方式，并研究了产品在此状态下允许的保存时限问题，解决了企业生产肝素钠及低分子肝素过程中产品因突发事件或设备故障导致滞留而又无法以干燥固体粉末状态进行储存和转运的问题。取12个月内样品，检测其分子量、效价及结构双糖方面，并与相应干燥粉末状态检测数据进行对比，我们确认将多糖类肝素产品使用有机溶剂（甲醇、乙醇、丙酮）从其溶液中分离，除尽上清并使用乙醇进行液封，隔离空气，15～25℃环境下进行保存，12个月内其分子量、效价及双糖结构不会发生变化。但是在考察过程中发现，6个月后，肝素钠、达肝素钠和依诺肝素钠有轻微程度的颜色加深现象，如果后续工艺没有氧化步骤，建议将保存时间控制在6个月内。本文考察的保存温度在15～25℃，接近车间真实生产环境温度，增加了此保存方式的适用性。不同肝素制剂的保存通常建议在30℃以下或阴凉处，较低的温度能增加产品的稳定性。如果条件允许，将肝素湿品沉淀贮藏于2～8℃环境低温冷藏库，将更有益于产品的长时间保存。