响应面法优化银叶金合欢组培快繁体系

武爱龙，潘浩汉，吴建阳，卜 浩

(1.湛江幼儿师范专科学校， 广东 湛江 524037；2.岭南师范学院基础教育学院， 广东 湛江 524037)

银叶金合欢Acaciapodalyriifolia属豆科含羞草亚科植物，国内早期又叫珍珠相思、真珠相思、昆士兰银条等，原产澳大利亚[1]。该树适应性强，生长速度快，树形优美，花繁叶茂，花朵金黄色，花期长，叶片呈银绿色，同时银叶金合欢可用于景观造型，观叶、观花效果都非常好，是园艺园林绿化的优良树种，具有较高的生态、经济和社会价值。因此，银叶金合欢广泛应用于华南地区城市绿化和生态景观林中[2]。

银叶金合欢优良的种苗主要来自进口，成本昂贵。目前，银叶金合欢主要采用播种、扦插、压条、嫁接、分株等方法进行繁殖，但效果不理想。国内关于银叶金合欢的繁殖主要是通过播种繁殖[3-7]，但是其种皮结构致密，且种子外部具有蜡状角质层，透气性透水性极差，不经处理的种子发芽率很低。植物组织培养技术具有增殖系数大、生产周期短、可以常年生产等优点, 因此组培技术广泛应用于各种植物种苗的快速繁殖，但是有关银叶金合欢的组培快繁研究不是很多，只有李蕊萍等[6-7]对银叶金合欢做过初步的组培研究，方法比较传统。响应面分析法(response surface methodology，RSM)是近几年来国内外学者常用的试验设计优化方法，可以减少试验次数，使用方便，回归预测性好[8]，已在植物组织培养研究中广泛应用[9-10]。本研究采用组培所需的基本培养基MS、激素(6-BA、IBA、GA3、NAA)为培养基原料，并基于单因素的预试验基础上，参考Box-Behnken试验设计原理，用响应面法将各因素的相互关系进行拟合分析，研究各因素与响应值的关系，从而优化银叶金合欢的组培条件，以期为今后相关研究提供理论实践基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

银叶金合欢采自于湛江东盟城的东菊公园。2018年1月，选择连续晴天3 d以上，挑生长健壮、无病虫害的植株切取当年生含腋芽枝条作为诱导材料。

1.2 材料预处理

先用酒精消毒后的手术刀将含有腋芽的当年枝条，从其母株上切下，切除枝条上的叶部结构后，用流水冲洗干净，放室内晾3 d。随后，将其放入5%洗洁精溶液中浸泡30 min，软毛刷洗净后流水冲洗30 min，切成长1.0～2.0 cm带腋芽的茎段，在超净工作台上先用75%酒精消毒1 min，再用0.2% 升汞(加几滴吐温-20)浸泡消毒20 min，最后用无菌水冲洗5～7次备用。

1.3 接种

将消毒洗净后的带腋芽茎段放在无菌超净台上1 h，等带腋芽茎段表面水分晾干后，切去带腋芽茎段两端坏死部分，最后将带腋芽茎段接种到诱导培养基中,每次接种每种处理10瓶，每瓶接种1株，3次重复，所用培养瓶直径6.6 cm，高度9.5 cm，容量为240 mL。

1.4 试验方法

1.4.1不定芽诱导培养 采用统计软件Design-expert 8.0.5进行中心组合试验(Central Composite Design,CCD)设计，对影响银叶金合欢茎段诱导出不定芽培养基激素浓度配比进行研究,以获得不定芽最佳诱导培养基。基于前期单因素预试验,得知影响银叶金合欢茎段诱导不定芽诱导率的激素有6-BA、IBA、GA3。本研究采用响应面试验设计优化方案,以6-BA、IBA、GA33种激素的浓度为三因素，以诱导率为响应值(表1)，共17个处理。将步骤1.3所选取的带腋芽茎段外植体接种于诱导培养基中无菌的带腋芽茎段接入到诱导培养基上,每个处理接种30瓶,每瓶接种1个茎段,光照时间12 h·d-1，光照强度为2 000 lx。培养30 d后观察记录发芽个数,并计算各诱导培养基诱导率，探讨最佳的诱导培养基。

表1 银叶金合欢不定芽诱导培养基响应面试验因素水平

1.4.2增殖培养 本试验在前期单因素预试验基础上, 得知增殖培养3种激素6-BA、IBA、GA3有效的浓度范围分别为0.2～0.8 mg·L-1、0.2～1.0 mg·L-1、0.1～0.3 mg·L-1。根据Box-Behnken试验设计原理，以增殖系数为响应值(表2),确定增殖培养中激素组合的最佳配比，共17个处理。将诱导培养所得的不定芽分成单株，转接至含有不同的增殖培养基中进行增殖。每个试验接种30瓶,每瓶1个不定芽,培养30 d后观察记录不定芽的增殖情况,探讨最佳的增殖培养基。

表2 银叶金合欢增殖培养基响应面试验因素水平

1.4.3生根培养 本试验在前期单因素试验基础上,得到银叶金合欢生根培养2种激素IBA、NAA有效浓度范围分别为0.4～0.8 mg·L-1、0～0.2 mg·L-1,通过CCD中心试验设计，以生根率为响应值(表3)，确定生根培养中激素组合的最佳配比,共13个处理。将增殖培养所得的2～3 cm高的无根芽苗分成单株,接种生根培养基中。每个处理接种10瓶,每瓶2个外植体，重复3次；培养40 d后观察记录生根情况，并计算各生根培养基中生根率。

表3 银叶金合欢生根培养基响应面试验因素水平

1.5 培养条件

以上培养基中，诱导以及增殖基本培养基都是MS培养基，蔗糖浓度均为30 g·L-1，而生根基本培养基是1/2MS培养基，蔗糖浓度为15 g·L-1，培养基琼脂粉浓度均为6 g·L-1，pH 5.8～6.2。培养温度26℃左右，光照强度2 000 lx左右,光照时间12 h·d-1。

1.6炼苗移栽 移栽前将生根瓶苗放在室温25～30℃的环境下不开盖炼苗7 d，在移栽前1 d洗净根部的培养基之后用多菌灵或者高锰酸钾进行浸泡2 min消毒，随后移栽到消毒好的基质中，基质配置比例为黄心土∶沙(2∶1)，浇透水，再用薄膜覆盖保湿保温，并用遮阴网遮阴。20 d后，揭开薄膜进行常规水肥管理。经30 d的常规养护，即可成活。

1.7 数据统计与分析

利用Design Expert 8.0.6软件对所得数据进行分析,推测出最佳组合配方并进行实际试验验证。

诱导率(%)=(诱导出不定芽的瓶数/接种瓶数)×100;

增殖系数=新增芽数/接种总芽数;

生根率(%)=(生根苗数/接种总苗数)×100。

2 结果与分析

2.1 激素组合对银叶金合欢不定芽诱导的影响

外植体接种到诱导培养基10～15 d后茎段腋芽开始逐渐膨大，出现不定芽。部分茎段基部出现褐色分泌物，30 d开始统计不定芽的诱导率。从表4可知，17组组合都可以诱导出不定芽，但不同组合的诱导率存在很大的差异，诱导率的范围在13.56%～62.14%，其中第13组组合诱导率最高(6-BA浓度为2.0 mg·L-1,IBA浓度为0.6 mg·L-1,GA3浓度为0.2 mg·L-1)，达到62.14%，第5组组合(6-BA浓度为1.0 mg·L-1，IBA浓度为0.2 mg·L-1，GA3浓度为0.2 mg·L-1)诱导率最低13.56%，两者相差高达48.58%。通过观察发现，第5组也能够形成大量的愈伤组织，可能原因在于6-BA以及IBA浓度较高有利于诱导不定芽，而GA3浓度较高有利于能够产生愈伤组织。

2.1.1诱导率回归方程分析 以培养基中6-BA(A)、IBA(B)、GA3(C)为自变量因素，茎段诱导出芽的诱导率(Y)为响应值，根据试验结果(表4)得到回归方程为:Y=57.40+10.01A+1.33B-0.59-6.68×B-0.33A×C-2.73B×C-15.56A2-10.40B2-7.23C2,其中,相关系数R2=0.946 9,校正决定系数R2=0.878 7。该回归方程的P值=0.001 1<0.01,有极显著性；方程经失拟性检验分析得F=0.355 55,P>0.1,失拟不显著,由此可以看出，该回归方程拟合性好。表5显示,A、A2、B2达到差异极显著(P<0.01),AB、C2达到差异显著(P<0.05)。表明激素6-BA浓度对银叶金合欢外植体茎段诱导出不定芽有着极显著影响，且6-BA浓度与IBA浓度的交互作用对诱导出不定芽差异显著，IBA浓度与GA3浓度的交互作用对结果差异不显著。通过回归方程得到最优诱导芽的培养基中6-BA、IBA和GA3浓度分别为A=3.00 mg·L-1，B=0.35 (mg·L-1)，C=0.20 mg·L-1。

表4 不定芽诱导响应面试验设计与结果

表5 响应面二次回归方程方差分析

2.1.2响应值和等高线分析 通过拟合方程绘制因素间交互作用的等高线图和响应面图,6-BA、IBA和GA3浓度对银叶金合欢诱导不定芽影响。由图1可知,6-BA和6-BA以及6-BA和IBA的交互作用显著,6-BA和IBA交互作用较小。其中，6-BA浓度对不定芽诱导的影响最大，其次是IBA浓度，对植株再生频率影响最小的是GA3浓度。因此,可知银叶金合欢外植体诱导不定芽对培养基中6-BA的浓度变化较为敏感，而对IBA和GA3的敏感性次之,其敏感性大小为6-BA>IBA>GA3。

图1 6-BA、IBA和GA3浓度对银叶金合欢诱导不定芽影响的响应面和等高线

2.1.3最佳激素浓度配比及验证 通过二次回归方程的分析可得出银叶金合欢诱导培养基的最优条件为A=3.00 mg·L-1,B=0.35 mg·L-1,C=0.20 mg·L-1，最佳诱导率预测值为62.89%。为验证模型预测的有效性,本试验研究了模型推测出的银叶金合欢茎段芽诱导最佳激素配比为MS+3.0 mg·L-16-BA+0.35 mg·L-1IBA+0.2 mg·L-1GA3,该组合下银叶金合欢茎段的理论出芽率为62.89%。经实际试验观测,该组合的平均出芽率为62.35%,与预测值无显著差异，证明响应面法可以有效优化银叶金合欢诱导培养基，其试验方案具有实际意义和可行性。

2.2 激素组合对银叶金合欢茎段增殖系数及生长情况

从表6可知，15个不同组合增殖系数为1.82～3.69，其中第15组组合(6-BA0.8 mg·L-1+IBA0.3 mg·L-1+GA30.1 mg·L-1)增殖系数最高，达到3.69；第4组组合(6-BA 0.2 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1+GA30.1 mg·L-1)增殖系数最低，为1.82，2个组合相差1.87。通过观察发现，添加IBA 0.3 mg·L-1,随着6-BA浓度的增加，增殖系数呈现先上升后下降的趋势，当6-BA为0.8 mg·L-1时，不定芽长势较慢，呈现玻璃化现象；而GA3浓度上升的情况下，不利于不定芽的诱导分化。

表6 增殖培养试验设计与结果

2.2.1增殖系数回归方程分析 以培养基中6-BA(A)、IBA(B)、GA3(C)为自变量因素，增殖系数(Y)为响应值，根据试验结果(表4)得到回归方程为:Y=2.59+0.43A+0.28B-0.41C+0.22A×B-0.48×A×C-0.085×B×C-0.25×A2-0.050×B2+0.044×C2,其中,相关系数R2=0.987 4,校正决定系数R2=0.971 3。该回归方程的P值<0.000 1,有极显著性；方程经失拟性检验分析得F=0.404 2，P>0.1,失拟不显著,由此可以看出，该回归方程拟合性好。从表7可知，A、B、C、AB、AC、A2回归系数极显著(P<0.01)。表明激素6-BA、IBA、GA3浓度对银叶金合欢外植体诱导出不定芽差异极显著，且6-BA浓度与IBA浓度的交互作用对诱导出不定芽差异显著，但是IBA浓度与GA3浓度的交互作用对结果影响不显著。通过回归方程得到最优增殖培养基的激素浓度6-BA、IBA和GA3分别为A=0.66 mg·L-1，B=0.45 mg·L-1，C=0.11 mg·L-1。

表7 响应面二次回归方程方差分析

2.2.2茎段增殖响应面和等高线 根据Design-Expert 8.0.6软件绘制因素间交互作用的等高线图和响应面图。由图2可知, 6-BA、IBA、GA3的交互作用显著。因此,推测银叶金合欢增殖对培养基中6-BA、IBA、GA3的浓度变化都比较敏感，尤其是6-BA在培养基中的浓度变化对银叶金合欢茎段的增殖倍数影响更明显。

图2 6-BA、IBA和GA3浓度对银叶金合欢增殖影响的响应面和等高线

2.2.3最佳激素浓度配比及验证 为验证模型预测的有效性,本试验对模型推测出的最佳激素配比MS+0.66 mg·L-16-BA+0.45 mg·L-1IBA+0.11 mg·L-1GA3进行验证试验,该组合配比下银叶金合欢茎段理论增殖倍数为3.785 74。经实际试验可得到平均增殖系数为3.68,与预测值基本一致, 比原17个组合中最高增殖倍数高0.10，说明方程与真实试验拟合度较好，证实了该模型的有效性。

2.3 激素组合对银叶金合欢茎段生根率的影响

将增殖培养后, 将高为2～3 cm的丛生芽苗切割为单个植株接入到不同的生根培养基中诱导生根。由表6可知,13组组合都可以诱导出不定根，但不同组合的生根率有所不同，各组合生根率为43.31%～81.68%，其中第8组组合(IBA 0.6 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1)生根率最高，达到61.68%，第7组组合(IBA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1)生根率最低，为23.31%；两个处理组合相差37.37%。通过观察发现，当IBA、NAA激素浓度较低时，生根效果总体差异不显著，芽长势也无明显区别，长势较好，苗比较健壮，随着IBA、NAA浓度的升高，生根率呈先上升后下降趋势，同时形成大量愈伤组织，导致苗长势较差，可能由于前期增殖培养中，所形成的丛生芽植株所蓄积的激素浓度也较多，导致后期生根过程中，激素浓度越高越会抑制苗的长势。

2.3.1生根率回归方程分析 以培养基中IBA(B)、 NAA(C)为自变量因素，生根率(Y)为响应值，根据试验结果(表8)得到回归方程为Y=78.65+5.99A+2.81B+4.95×A×B-18.62A2-4.55B2,其中,相关系数R2=0.940 9,校正决定系数R2=0.898 6。该回归方程的P值=0.000 4<0.01,有极显著性；方程经失拟性检验分析得F=0.157 5,P>0.1,失拟不显著,由此可以看出，该回归方程拟合性好。从表8可知,A、A2差异极显著(P<0.01),AB差异显著(P<0.05)。表明激素6-BA浓度对银叶金合欢外植体诱导出不定芽有着极显著影响，且6-BA浓度与IBA浓度的交互作用对诱导出不定芽有显著性影响。通过Design-Expert V 8.0.6软件得到最优诱导芽的培养基的6-BA、IBA和GA3浓度分别为A=0.64 mg·L-1，B=0.14 mg·L-1。

表8 生根培养试验设计与结果

表9 响应面回归系数方差分析

2.3.2响应面和等高线 通过拟合方程绘制因素间交互作用的等高线图和响应面图,考察响应面的形状。由图9可知,IBA和IBA以及IBA和NAA的交互作用显著,NAA和NAA交互作用不显著。其中，6-BA浓度对植株不定芽诱导的影响最大。因此,推测银叶金合欢生根对培养基中的敏感性为IBA>NAA。

图3 IBA和NAA浓度对银叶金合欢生根影响的响应面和等高线

2.3.3最佳激素浓度配比及验证 通过二次回归方程的分析可得出银叶金合欢生根培养基的最优条件为A=0.64 mg·L-1，B=0.14 mg·L-1,经计算，该配比培养条件下银叶金合欢茎段的理论生根率为79.906 7%。而通过实际试验测试获得的平均生根率为85.67%,与预测值基本一致,比原13个组合中最高生根率高出3.99%，说明方程与真实试验拟合度较好，证实了该模型的有效性。

2.4 组培苗移栽

将生根培养30 d后的组培苗，移至温室中不开盖炼苗7 d，这样可以保持瓶内外环境的一致，使得组培苗能够更好地适应室外的自然环境。移栽前1 d，将培养瓶旋开，之后将苗取出，洗净根上黏附的培养基，同时用多菌灵或者高锰酸钾溶液浸泡消毒2 min，随后移栽至经消毒处理的基质中，基质配置比例为黄心土∶沙(2∶1)，覆盖薄膜保温保湿，并用遮阴网遮阴。20 d后，揭开薄膜进行常规水肥管理，1个月后调查其存活率可达到90%以上。

3 讨论与结论

响应面分析法是一种可以减少试验次数，使用方便，回归预测性好的优化分析方法[11]。相对于以往的分析方法，响应面分析法获得各个试验参数组合更加精确，可以减少试验次数，进而减少试验浪费。在植物组培试验中,最常用的试验方法是正交试验设计,但是正交试验方法只是对一个个孤立的试验进行分析，无法找到各个因素与响应值之间的关系。牟会荣等[12]、蔡厚道[13]利用以上两种试验设计方法进行试验设计与研究,均发现响应面法优于正交法。

目前国内对银叶金合欢的研究主要集中对种子萌发特征[5]、育苗技术[14]等方面，国外对银叶金合欢的研究主要在于分类特征、种类鉴定、分布以及引种栽培，关于优化银叶金合欢组培培养基的响应面法还没见报道，由于银叶金合欢属于豆科金合欢属常绿小乔木，又属于相思类植物，因此，本研究主要参考金合欢属或者相思类植物的组培方法。曾少玲等[15]在马大杂种相思无性系的组培快繁试验中马大杂种相思理想的外植体材料是当年生枝条第3～5个腋芽茎段；王鸿等[16]在16年生大叶相思高效芽诱导、增殖体系研究中发现最优外植体是8月取当年生枝条第3～5腋芽茎段。因此，本研究在不定芽诱导培养中选择的银叶金合欢外植体为带腋芽的茎段。同时在诱导培养中，采用CCD设计筛选出最优的诱导培养基MS+3.0 mg·L-16-BA+0.35 mg·L-1IBA+0.2 mg·L-1GA3，实际诱导率为62.35%，高于李蕊萍等[6]报道的诱导率54.33%，当然根据响应面法因素间交互作用的等高线图和响应面图分析发现在最优诱导培养基中6-BA浓度对不定芽诱导的影响最大，其次是IBA浓度，对植株再生频率影响最小的是GA3浓度，这与李蕊萍等[6]对银叶金合欢诱导试验中所使用的基本培养基以及激素种类一致。在银叶金合欢的增殖培养中，筛选出最优的增殖培养基MS+0.66 mg·L-16-BA+0.45 mg·L-1IBA+0.11 mg·L-1GA3，该组合的银叶金合欢茎段实际平均增殖系数为3.68，高于李蕊萍等[6]报道的银叶金合欢组培增殖系数(3.44)、王鸿等[16]报道的大叶相思组培增殖系数(2.63)以及黄烈健等[17]报道的黑木相思组培增殖系数(3.12)。在增殖培养过程中，激素6-BA、IBA、GA3浓度对银叶金合欢外植体诱导不定芽存在极显著差异，且6-BA浓度与IBA浓度的交互作用对诱导不定芽影响差异显著，但是IBA浓度与GA3浓度的交互作用对结果影响不显著。激素6-BA浓度对银叶金合欢外植体诱导不定芽有极显著影响，且6-BA浓度与IBA浓度的交互作用对诱导不定芽有显著影响。本研究筛选出的银叶金合欢最优生根培养基为1/2MS+0.64 mg·L-1IBA+0.14 mg·L-16-BA，在此培养基配方下银叶金合欢茎段的实际平均生根率为85.67%，高于李蕊萍等[6]报道的银叶金合欢组培生根率(67.10%)，低于黄玉梅等报道的黑木相思组培生根率(94.45%)[18]、宁昭然等[19]报道的黑木相思组培生根率(96.63%)以及王鸿等[20]报道的卷荚相思组培生根率(96.11%)，原因可能是添加不同激素种类以及浓度配比的不同而导致。总体来说银叶金合欢生根率低于其他相思类植物；同时IAA和IBA两种生长素交互作用比单独作用能使相思类植物生根率提高，但其具体机理还需要进一步深入研究。

本研究以银叶金合欢诱导率、增殖系数、生根率作为响应值，结合CCD试验设计回归分析各处理之间的总体差异，对得到的试验结果再进行验证，试验结果可靠。因此，响应面法在植物组织培养不同品种、不同培养条件、不同的培养过程方面应用前景将非常广泛，极大促进植物组织培养研究技术的进步。