激素模拟妊娠后激素停撤大鼠产后抑郁模型的改进与评价*

王晓菲 严 语 赵 展 何 沐 王璟萱 武军驻 杨怀洁

(1.三峡大学人民医院，宜昌 443000)(2.武汉大学人民医院，武汉 430060) (3.武汉大学中南医院，武汉 430071)(4.武汉大学基础医学实验教学中心，武汉 430000)

产后抑郁(postpartum depression,PPD)是产后精神疾病的最常见类型之一，发病率在7.30%～37.14%[1-2]。产后抑郁患者家庭和社会角色受损，对社会产生不良的影响[3]。该病以患者主观感受为主，缺乏特异性病理生理指标，发病机制至今仍尚未明确[4]。对该病的病因研究及药物研发依赖于科学的产后抑郁动物模型。

目前产后抑郁动物模型主要有三类：(1)应激所致产后抑郁模型:在母鼠妊娠或产后，使母鼠遭受社会刺激(多次雄性入侵)、母仔分离、母体免疫激活或其他刺激(电击、禁食、束缚等)，显示出抑郁样行为，该模型能较真实地模拟女性孕期的部分危险因素，但受大鼠个体差异影响，模型不稳定，容易出现假阳性[5]；(2)转基因产后抑郁模型，常见的有FRL(flinders resistant line) 大鼠、WKY(Wistar-Kyoto)大鼠等[6]，转基因产后抑郁模型相对稳定，个体差异小，但大鼠适应力差，价格昂贵[7]；(3)激素诱导产后抑郁模型，常见有两种：激素模拟妊娠后激素停撤(the hormone withdrawal after hormone-simulated pregnancy model)和高皮质醇诱导。激素诱导模型可以捕获雌、孕激素波动引起的情绪改变，个体差异小。其中高皮质醇模型需要大鼠为怀孕状态，在实验过程中不好控制与把握，而激素停撤模型采用外源性激素注射模拟妊娠和产后，实验中更好操作[8]。本研究拟在复制激素停撤的大鼠产后抑郁模型基础上，针对实验中出现而目前已有文献中未提及的问题进行改进，以期为产后抑郁症的基础研究提供更稳定的动物模型建模及可靠的评价方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物:清洁级Sprague Dawley(SD)雌性大鼠，5～6月龄，体质量(200±10)g，共25只。

1.1.2主要试剂与药品:注射级苯甲酸雌二醇，批准文号为：兽药字(2014)070012511；注射级黄体酮，批准文号为：兽药字(2014)070011439(均吉林省华牧动物保健品有限公司)。橄榄油，生产批号：N1011A(美仑生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1激素模拟妊娠后激素停撤大鼠产后抑郁模型的建立

1.2.1.1去势手术：预养一周的大鼠随机分为2组：正常组(n=10)和实验组(n=15)。实验组行去势手术。腹腔注射2%戊巴比妥钠(0.2 mL/100 g)麻醉，左侧位固定于手术台。备皮、消毒大鼠脊柱旁开一横指、肋缘后一横指处的皮肤。自腰椎沿背部正中线向下切开皮肤，切口为纵行，长约1 cm。圆头剪钝性剥离皮肤与肌肉。扩张肌肉层，暴露内部组织，定位右侧子宫角，用镊子轻夹住周围脂肪组织并将其拉出体外，沿子宫角向上找到输卵管及卵巢，结扎后摘除，将子宫体送回腹腔，同法摘除对侧卵巢。分别缝合肌肉、皮下脂肪层及表皮。连续3 d每天注射0.1 mL青霉素预防感染。术后将大鼠置于笼中恢复。正常组不做处理。

1.2.1.2阴道涂片观察：于去势手术后第2天开始对大鼠进行阴道冲洗检查，每日1次，连续两个生理周期(共10 d)。用吸管吸取约100 μL 0.9%氯化钠溶液，轻吹入大鼠阴道中，反复吹吸数次，待0.9%氯化钠溶液将大鼠阴道内分泌物冲下后将0.9%氯化钠溶液吸回，滴入96孔板中。光镜下观察大鼠阴道分泌物的细胞学变化，判断大鼠是否存在动情周期的改变。有周期变化者表示卵巢未切除干净，大鼠应剔除不用。

1.2.1.3雌、孕激素注射：从去势手术结束后第9天开始激素注射模拟大鼠“妊娠”状态下的激素分泌。实验组大鼠每日皮下注射雌二醇注射液0.1 mL (2.5 μg)及黄体酮注射液0.2 mL(4 mg)，连续注射16 d，之后改为每日注射雌二醇注射液0.1 mL (50 μg)，连续注射7 d。注射开始后的第24天(即“产后”第2天)停止激素注射。对照组大鼠前16 d每日皮下注射橄榄油0.3 mL，后7 d每日注射橄榄0.1 mL。

1.2.2 激素模拟妊娠后激素停撤大鼠产后抑郁模型评价

1.2.2.1旷场实验(open field test,OFT)：实验采用无盖敞箱，大小为100 cm×100 cm×40 cm，敞箱四壁、底部均用黑色、不透明材料制成。位于敞箱顶部的摄影机全程记录实验过程。箱底外围16块方格设定为外场，中间9块方格设定为内场。内场中央为开始测试的起点[9]。实验前先进行预实验使大鼠适应敞箱，建模成功后第2、4天正式实验，每只大鼠每次测试5 min。每只大鼠实验结束，需清理动物残留的粪便、尿液和毛发，箱底和四壁用酒精纱布擦拭干净，酒精自然风干后再进行下一只测试[10]。测试结果采用Smart3.0分析。具体步骤见参考文献[9]。

1.2.2.2强迫游泳实验(forced swimming test，FST)：实验采用透明圆柱烧杯，直径30 cm，高60 cm，内盛温水深约48 cm，水温保持在23～25 ℃。实验时，操作者将大鼠放入盛有温水的烧杯内，用摄像系统记录动物5 min 内的运动状态，分析不动状态总时间(不动状态是指动物放弃主动挣扎，躯体处于漂浮不扭动状态)。5 min后捞起大鼠，干净干纱布擦干大鼠体表的水，还回原来笼中。每只大鼠结束实验后均需换水[11-13]。强迫游泳实验在产后的第6、7天进行，结果采用Smart3.0软件记录分析。

2 结果

2.1 两组大鼠阴道分泌物的变化比较

与正常组相比，实验组的大鼠没有动情周期的变化，趋于稳定。

2.2 两组大鼠行为学实验比较

2.2.1旷场实验：实验组大鼠活动性下降，旷场实验水平运动距离减短，与正常组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组大鼠行为学检测比较Table 1 Comparison of behavioral test between two groups of rats

2.2.2强迫游泳实验：实验组大鼠在强迫游泳实验中不动时间显著延长，与正常组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

3 讨论

怀孕、分娩虽属于生理现象，但孕产妇受体内激素的改变容易情绪波动，产生焦虑，甚至抑郁。罹患产后抑郁，产妇情感淡漠，兴趣减少，照顾婴儿能力下降，严重者甚至产生自杀或杀婴的意念或行为，对个人、家庭以及社会影响巨大。由于产后抑郁病因复杂且尚未明确，对该病的基础研究和治疗药物的研发依赖于产后抑郁动物模型。

女性孕晚期雌激素和孕激素逐渐升高，能分别达到正常月经周期水平的约100倍和10倍。分娩后，这些激素在产后3～7 d迅速下降至卵泡期早期水平[14]。激素大幅度波动被认为是女性出现产后抑郁的重要因素之一[15-17]。GALEA等[18]建立了激素模拟妊娠后激素停撤诱导的产后抑郁模型。相比较其他建模方式，该模型能更好的模拟产妇妊娠分娩过程激素波动情况，具有更强的针对性和特异性，目前在基础研究中运用较广[19-21]。但是已有文献对建模过程、结果及效果仅略微提及，并未做详尽的描述[16,19,22]。本研究通过复制经典的产后抑郁大鼠激素停撤模型[18]，探究建模过程中的诸多问题，并通过行为学实验对此模型作出评价。

3.1 激素模拟妊娠后激素停撤大鼠产后抑郁模型建模过程中实验方法改进

3.1.1麻醉药物的选择：目前动物实验常用的麻醉剂有乌拉坦、戊巴比妥钠等。使用乌拉坦，大鼠麻醉时间长，死亡率高达33.34%，解剖后发现肺肠淤血胀气严重，有腐臭气味，这一结果与参考文献[23]报道的一致，戊巴比妥钠效果相对较好，极大降低了死亡率。

3.1.2术后大鼠处理：手术后大鼠应单笼饲养。实验中大鼠同笼喂养致死3例，为麻醉后苏醒的大鼠撕咬同笼尚未清醒的大鼠所致。

3.1.3去势手术结果评估：既往的研究报道以结晶紫及其改良的快速革兰染色阴道涂片为主[24-25]，但在实际操作中结果不甚理想，改用0.9%氯化钠溶液冲洗后直接在光镜下观察，操作简单效果好。

3.1.4注射油的选择：预实验中我们分别使用了大豆油、橄榄油和芝麻油。实验显示芝麻油不易吸收，大豆吸收效果好于橄榄油和芝麻油，但大豆油中含有异黄酮等植物性雌激素，能与雌激素受体结合诱导产生弱雌激素作用[26]，为避免建模过程中的干扰，选择橄榄油为注射油，实验显示吸收效果优于芝麻油。

3.2 激素模拟妊娠后激素停撤大鼠产后抑郁模型建模后行为学检测

与普通的抑郁症类似，产后抑郁模型评价也需要采用行为学实验，如旷场实验、强迫游泳等。旷场实验评价模型动物在新的环境中自主行为与探究行为。当大鼠出现抑郁样行为学改变时，自主性与探究性会相应下降。实验结果显示，产后抑郁模型组大鼠水平运动距离减短，出现抑郁症状。强迫游泳实验是评价动物行为绝望的经典方法，实验结果显示，产后抑郁模型组大鼠在强迫游泳中不动时间显著延长，反映了行为绝望这一典型抑郁症状。

在预实验中，采用糖水偏好实验对两组大鼠进行检测，但并未观察到两组大鼠的差异。在既往对抑郁的基础研究中证实抑郁大鼠糖水偏好系数明显降低[27-28]，可能是两种抑郁建模方式的区别，产后抑郁模型主要是激素模拟妊娠后激素停撤导致的抑郁，和慢性应激所致抑郁症状的病因并不一样，最终导致大鼠抑郁后的核心表现差异。综上实验结果证实，旷场实验、强迫游泳实验可以作为检测指标对产后抑郁动物进行建模评价。

实验中发现激素停撤产后抑郁大鼠模型行为学检测时间特殊性。预实验中我们在建模后第1、2、4周进行测验发现，第一周大鼠抑郁症状显著，和正常组对比差异有统计学意义，但到第2、4周时抑郁样行为已不显著。激素停撤产后抑郁大鼠的抑郁症状可能与激素水平的变化密切相关，当外源性给与的激素停止后，产后抑郁大鼠可能会自愈。本研究认为激素模拟妊娠后激素停撤大鼠产后抑郁模型能较好的模拟妊娠、分娩体内激素的变化对情绪的影响，适合开展产后抑郁的基础研究。建议对产后抑郁大鼠行为学检测应在建模后一周之内进行[29]。

近年来临床医护人员对女性产后抑郁日益关注与重视，建立良好的动物学模型是开展研究的关键，不断完善动物模型和行为学评价指标对于产后抑郁病因与机制的研究至关重要，本研究对激素模拟妊娠后激素停撤大鼠产后抑郁模型进行了细节探讨与改良，提高了建模成功率，为进一步开展产后抑郁的研究提供借鉴与帮助。