和厚朴酚对心梗小鼠的心肌保护作用研究

江丽青,张溧昀,师恒,杨家昌,刘金成,段维勋

(空军军医大学西京医院心血管外科,西安 710032)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是心力衰竭最重要的病因之一,在全球范围内发病率和死亡率都很高,严重危害人类生命健康。但随着早期再灌注策略的实施以及治疗方法的改进,急性心梗30 d 内死亡率显著降低,其预后效果也获得了很大改善[1-3]。 但生存率的提高伴随的是心梗后慢性心衰病人明显增多,这与心梗后一系列病理性心肌重构密切相关[4-5]。 目前,临床上缺乏针对心梗后病理性心肌重构的有效防治药物,随着中医药研究的发展,中药在心梗预防和治疗方面起到的作用日益显著。

和厚朴酚(honokiol,HKL)是一种从木兰科植物中提取的多酚类化合物,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤以及神经保护等多种药理作用,已被广泛用于中药制剂研究[6-10]。 近年来,HKL 在心血管疾病方面的作用也备受关注,如Tsai 等[11]发现,给大鼠静脉注射HKL,可显著降低心肌缺血后左室心律失常的发生率并缩短持续时间。 Pillai 等[12]亦证实HKL 不仅可以通过改善线粒体功减轻多柔比星引起的心脏毒性,也可以阻断甚至逆转心肌肥厚反应的发生。 虽然Wang 等[13]、Zhang 等[14]已经发现HKL 能明显减轻大鼠的心肌缺血/再灌注损伤,然而,其在小鼠急性心梗后近远期治疗效果及其具体分子机制还尚待研究。 本研究将探讨HKL 对急性心梗小鼠心肌损伤的影响及其可能的调控机制,为HKL 新的临床药用价值提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

8 周龄SPF 级雄性C57BL/6J 小鼠80 只,体重20 ～ 25 g,购自空军军医大学动物实验中心【SCXK(陕)2019-001】,小鼠由空军军医大学实验动物中心饲养【SYXK(陕)2019-001】。 饲养期间所有小鼠自由饮食,12 h 循环光照,温度24 ～ 26℃,湿度50% ～ 60%。 所有操作均符合空军军医大学实验动物中心实验伦理学要求(IACUC-20190115)。

1.1.2 主要试剂与仪器

和厚朴酚(美国Sigma-Aldrich 公司,化学合成物,纯度 ≥ 98%,批号:H4914);戊巴比妥钠(北京索来宝有限公司,中国,批号:57-33-0);SIRT1 抑制剂EX527(美国Sigma-Aldrich 公司,批号:E7034);SIRT1(GR3392540-1)、Bcl-2(GR3390921-1) 一抗(美国Abcam 公司);Bax(美国CST 公司,批号:12)、 GAPDH ( 美 国 Proteintech 公 司, 批 号:00081503),Ac-Foxo1(美国Santa Cruz 公司,批号:F1714)、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 二抗(中杉金桥,中国,批号:200830803);BCA 蛋白定量试 剂 盒( 美 国 Thermo Fisher 公 司, 批 号:VK314219);TUNEL 试剂盒(德国Roche 公司,批号:49330900);DAPI 染液(美国Sigma-Aldrich 公司,批号:D9542);IL-β、IL-6、TNF-α 检测试剂盒(美国Thermo Fisher 公司,批号分别为;5EEUZ9PLRK、KZ9XUYNEYN、3B164BNQLX);Vevo3100 小动物超声仪(Visual-Sonics 公司,加拿大);FV10-ASW 激光共聚焦显微镜(Olympus 公司,日本);Western 发光照相系统(Bio-Rad 公司,美国)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立

小鼠心肌梗死模型是聘请美国Thomas Jefferson大学的Gao Erhe 教授构建,具体方法参照文献[15],结扎冠脉左前降支,结扎线下方心肌缺血变白且心电图显示ST 波倒置,代表造模成功,模型成功率达98%以上。

1.2.2 实验分组及给药方式

将80 只小鼠随机分成4 组,每组20 只,即Sham 组、MI + V 组、MI + HKL 组、MI + HKL + EX组。 治疗组在行心梗手术前1 周开始口服HKL(5 mg/(kg·d),溶于 ＜ 1% DMSO 的纯净水中),抑制剂组除按前面剂量口服HKL 外,腹腔注射Ex527 抑制剂,每5 d 1 次(5 mg/(kg·d),溶于 ＜ 1% DMSO的无菌生理盐水中),注射6 次,HKL 给药剂量参照文献[14]。

1.2.3 心脏功能检测

各组小鼠在心梗术后第28 天,剔除小鼠胸前毛,每组随机取5 只用异氟烷麻醉小鼠并将其固定于恒温检测台上,用小动物超声仪采集二维超声心动图像,并用软件计算出相应的左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)与左室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)等心功能指标。

1.2.4 血清炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的检测

超声检测小鼠心功能后,使用异氟烷麻醉小鼠并固定于小动物操作台上,颈部消毒,眼科剪沿颈前正中线剪开并剥离出颈动脉,剪断后收集血液,静置30 min 后离心收集上层血清,参照ELISA 检测试剂盒说明书要求,检测各组血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量。

1.2.5 心肌组织活性氧簇生成量检测

小鼠MI 术后第28 天,采集完血液后取下小鼠心脏,取5 个用预冷的PBS 洗涤后,在液氮中快速冷冻,用冰冻切片包埋剂处理后并切成5 μm 厚度组织切片。 然后,用DHE 和DAPI 染料对组织切片进行染色,光镜下扫描并拍照,使用Image-Pro Plus软件测定每组中的乙锭荧光。

1.2.6 心肌组织TUNEL 检测

小鼠MI 术后第28 天,采集完血液后取下小鼠心脏,取5 个浸泡在4%多聚甲醛,石蜡包埋后切片备用,按TUNEL 常规染色步骤染色,光镜下扫描并拍照,然后统计每组心肌细胞凋亡率,以绿色凋亡小体个数/蓝色核个数表示细胞凋亡率。

1.2.7 心肌组织SIRT1、Ac-Foxo1、Bax、Bcl-2 蛋白表达检测

小鼠MI 术后第28 天,采集血液后取下小鼠心脏,取左室部分组织称重,在预冷PBS 中剪碎,离心5 min,去除上清,加入相应体积的裂解液并进行组织匀浆。 然后在4℃条件下充分裂解20 min,再以12 000 r/min 转速离心20 min。 采用BCA 法检测上清液中蛋白浓度,其余上清液以1 ∶4 的比例与蛋白上样缓冲液(5 ×)混合后煮沸使蛋白变性,-80℃冰箱保存,待用。 经蛋白凝胶电泳分离后,用湿转法将蛋白转移到PVDF 膜上,5%脱脂牛奶封闭后,切膜,于4℃条件下孵育一抗,稀释比例为:SIRT1、Ac-Foxo1、Bax、 Bcl-2 均 为1 ∶ 1000, GAPDH 为1 ∶5000,孵育过夜,TBST 洗脱3 次,每次10 min,分别加1 ∶5000 HRP 标记的二抗(山羊抗鼠及山羊抗兔),室温孵育2 h,TBST 洗脱3 次,每次10 min,使用ECL 化学发光液进行曝光显影,采用Bio-Rad 照相系统进行拍照和并用Image Lab 软件分析蛋白的相对表达量。

1.3 统计学分析

实验数据用GraphPad Prism 8.0 统计学软件进行分析,符合正态分布的计量资料以平均值 ± 标准差(±s)表示;多组之间的比较通过One-ANOVA分析方法进行统计。P＜ 0.05 表示具有显著性差异。

2 结果

2.1 小鼠MI 后28 d 生存率及HKL 对MI 小鼠心功能的影响

小鼠行MI 手术后,观察28 d 生存情况,Sham组无死亡小鼠,MI + V 组、MI + HKL 组、MI + HKL+ EX 组均有死亡,3 组之间无显著性差异,但较Sham 组生存率明显下降(P＜ 0.01),如图1A。 小鼠MI 后第28 天超声心动图统计结果显示,与Sham组相比较,MI + V 组小鼠心功能损伤显著加重(P＜ 0.01);与MI + V 组比较,口服HKL 治疗后心功能明显得到改善(P＜ 0.01),而加SIRT1 抑制剂EX527 后显著抑制了HKL 的心功能改善作用(P＜ 0.05)(见图1B,图1C,图1D)。

2.2 口服HKL 治疗降低MI 小鼠血清炎症因子水平

小鼠血清检测结果显示,MI 术后小鼠血清中炎症相关因子IL-1β、IL-6、TNF-α 含量较Sham 组显著升高(P＜ 0.01),与MI+V 组比较,口服HKL 治疗后血清中炎症相关因子含量又显著下降(P＜0.01),而加SIRT1 抑制剂EX527 后,炎症水平又明显加重(P＜ 0.05)(见表1)。

表1 和厚朴酚对心梗小鼠小鼠血清炎症因子的影响(pg/mL,±s,n = 5)Table 1 Effect of honokiol on serum inflammatory factors in mice with myocardial infarction(pg/mL, ±s, n = 5)

表1 和厚朴酚对心梗小鼠小鼠血清炎症因子的影响(pg/mL,±s,n = 5)Table 1 Effect of honokiol on serum inflammatory factors in mice with myocardial infarction(pg/mL, ±s, n = 5)

组别Groups白细胞介素-1β IL-1β白细胞介素-6 IL-6肿瘤坏死因子-α TNF-α Sham 组Sham group 1.69 ± 0.08 1.82 ± 0.74 16.20 ± 5.42 MI + V 组MI + V group 9.66 ± 1.47a 8.95 ± 1.64a 109.80 ± 17.27a MI + HKL 组MI + HKL group 3.35 ± 0.63b 4.24 ± 1.61b 33.86 ± 11.30b MI + HKL + EX 组MI + HKL + EX group 5.40 ± 1.06c 6.62 ± 2.80c 46.28 ± 14.34c

2.3 口服HKL 治疗对MI 小鼠心肌组织氧化应激和心肌细胞凋亡水平的影响

心肌组织DHE 和TUNEL 染色结果显示,与Sham 组比较,MI + V 组氧化应激和凋亡水平明显加重(P＜ 0.01),与MI+V 组比较,口服HKL 治疗后显著改善了MI 小鼠心肌组织氧化应激和凋亡水平(P＜ 0.01),而加SIRT1 抑制剂EX527 后,这种改善作用又明显减弱(P＜ 0.05)(见图2)。

2.4 口服HKL 治疗对MI 小鼠心肌组织凋亡相关蛋白及SIRT1/Ac-Foxo1 信号通路的影响

与Sham 组相比较,MI + V 组凋亡相关蛋白Bax和SIRT1 信号通路下游蛋白Ac-Foxo1 的表达显著增加(P＜ 0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2 和SIRT1 信号的表达水平显著降低(P＜ 0.01);而口服HKL 治疗后可显著缓解MI 后心肌损伤,Bax 和Ac-Foxo1 的表达较MI+V 组明显降低(P＜ 0.01),Bcl-2 和SIRT1 的表达水平又明显升高(P＜ 0.01);加入SIRT1 抑制剂EX527 后,这种改善作用又明显减弱(P＜ 0.05)(见图3)。

3 讨论

本研究通过对急性心梗小鼠模型的实验研究发现,较假手术组,心肌梗死后小鼠28 d 内生存率明显下降,心功能明显变差;口服和厚朴酚治疗可以显著改善心梗小鼠的心功能,并显著降低小鼠血清中炎症因子水平,生存率略有改善但无明显差异。 和厚朴酚作为一种中药材中天然、安全的“靶向”药物,在心血管领域能够发挥多重积极的作用,如降血压、抑制动脉血栓形成、逆转心肌肥厚反应以及保护线粒体等[12,16-17]。 此外,和厚朴酚已被广泛用于减轻多个脏器缺血再灌注损伤的研究中。重要的是,Zhang 等[14]研究发现,和厚朴酚可以显著改善糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤后的心脏功能障碍,但其在急性心梗后如何发挥保护效应还鲜有研究报道。 因此,和厚朴酚对近远期缺血性心脏病的防治效果研究显得尤为迫切。

据报道,心梗后一系列病理变化包括心肌组织氧化应激增加、炎性细胞广泛浸润、心肌细胞死亡、心脏收缩功能变差等,这些导致心脏病理性架构变化,并最终导致心衰[5,18-19]。 张超等[20]研究发现,和厚朴酚可以通过减轻炎症因子水平和抗凋亡作用对D-半乳糖致腰椎间盘退变有明显治疗作用。本研究通过给予心梗小鼠口服和厚朴酚发现,治疗组可以明显降低小鼠心肌组织氧化应激水平,减少心肌细胞凋亡,同时抗凋亡蛋白Bcl-2 表达量显著增加,凋亡蛋白Bax 表达水平显著降低,表明和厚朴酚可通过降低小鼠血清炎症因子水平和心肌细胞凋亡率改善心梗后小鼠心功能。

SIRT1 是一种主要分布于细胞核中的去乙酰化酶,通过对一些组蛋白和非组蛋白的去乙酰化作用,参与调控多种组织细胞的生存、凋亡、生长、衰老以及物质代谢[21]。 此外,文献报道表明SIRT1 可通过抑制细胞凋亡、降低氧化应激与内质网应激水平、调控细胞自噬等途径来减轻心肌缺血再灌注损伤[22],那么,心肌梗死后和厚朴酚是否能通过激活SIRT1 信号发挥保护作用尚需证实。 本研究通过给心梗模型小鼠腹腔注射SIRT1 抑制剂EX527,同时给予和厚朴酚口服给药,发现加入抑制剂后,较单纯给药组,心肌组织氧化应激和心肌细胞凋亡水平明显增加,血清炎症因子也显著增加,同时和厚朴酚的心功能明显变差,SIRT1 下游分子Ac-Foxo1 表达显著增加。 因此,该研究表明和厚朴酚对心梗小鼠心功能的保护作用部分是通过SIRT1/Ac-Foxo1信号的抗凋亡作用实现的。

综上所述,该研究表明和厚朴酚可减轻心梗后小鼠心肌损伤,其潜在的作用机制可能是通过激活SIRT1/Ac-Foxo1 信号通路抑制心肌细胞凋亡,但其具体的下游机制仍需进一步研究。 因此,本研究将为和厚朴酚在临床上治疗心肌梗死提供可能的理论依据。

参 考 文 献(References)

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