核糖体成熟因子RimP、Era和RimJ的研究进展

张树军，张国文，白 靓，曹瑞珍

（内蒙古民族大学 医学院，内蒙古 通辽 028043）

核糖体是所有生物进行蛋白质合成的场所，无论是原核细胞还是真核细胞，核糖体的产生、组装和成熟都是一个快速、复杂且能量消耗巨大的细胞过程，包括几种rRNA和几十种核糖体蛋白质的合成、加工、折叠、成熟和结合。它沿着多条平行途径进行，并受到核糖体成熟（组装）因子的引导，虽然已经研究多年，但核糖体成熟（组装）因子在指导核糖体组装和成熟中的作用机制仍然不是很清楚［1］。RimP、Era和RimJ是大肠杆菌核糖体30S小亚基的成熟因子，促进30S小亚基的组装和成熟。此外，在细菌中一种蛋白质具有几种功能是普遍现象，除了促进30S小亚基的组装和成熟，RimP、Era和RimJ还对大肠杆菌的生长起着重要作用，RimP可影响翻译过程的保真性，Era参与细胞周期调控和凋亡，RimJ参与细胞对环境信号的反应等。笔者总结了RimP、Era和RimJ在30S小亚基组装和成熟过程中的作用以及它们的其他作用，为进一步揭示30S小亚基组装和成熟的过程以及RimP、Era和RimJ的其他功能提供依据。

1 大肠杆菌核糖体的组成与功能

原核和真核生物的核糖体都是由大小两个独立的亚基组成的精密分子机器。原核生物大肠杆菌核糖体的沉降系数为70S，其中，小亚基为30S，大亚基为50S，小亚基和大亚基都是由核酸和蛋白质构成的复合物，蛋白质占总重量的1/3，核酸主要是rRNA。30S小亚基由1个16S rRNA（1 542个核苷酸）和21个蛋白质（S1-S21）构成；50S大亚基由5S（120个核苷酸）和23S（2 904个核苷酸）2个rRNA和33个蛋白质（L1-L33）构成，大小亚基构成的核糖体负责解析mRNA上的遗传密码，并将tRNA上的氨基酸依次连接成肽链。

2 大肠杆菌核糖体小亚基的组装和成熟

大肠杆菌核糖体小亚基的组装和成熟过程主要包括细胞内rRNA和核糖体蛋白的合成、加工和组装。可分为四方面：（1）rRNA的转录、剪切以及碱基修饰。（2）核糖体蛋白的翻译以及翻译后修饰。（3）rRNA及核糖体蛋白的正确折叠。（4）核糖体蛋白与rRNA结合成为成熟的30S小亚基。

核糖体的组装和成熟是由十几种蛋白质指导的，包括伴侣（DnaK、RbfA、RimM）、GTPases（Era、Der、CgtE）、RNA重塑蛋白，如RNA解旋酶（DeaD、SrmB、DbpA）和RNA修饰酶，如甲基转移酶（KsgA、RrmJ）等［2］。研究发现，细菌内核糖体小亚基的组装是以16S rRNA的前体，即17S rRNA为初始物开始的，并且核糖体的组装过程与rRNA的转录过程相偶联，即在16S rRNA的转录合成还未完成时，核糖体的组装已经开始，这样可以加快核糖体的合成效率。所以，核糖体的组装是从rRNA的5’端开始的。为了确保核糖体的组装和成熟高效正确地进行，细胞内的一些蛋白有序地参与了核糖体的组装过程，这些蛋白被称为核糖体成熟（组装）因子。尽管它们的具体分子作用尚不清，但这些核糖体成熟因子被认为通过引导核糖体蛋白与rRNA结合，并通过动力学效应来引导rRNA折叠，从而促进核糖体的组装和成熟［2］。RimP、Era和RimJ是大肠杆菌核糖体30S小亚基的成熟因子，促进30S小亚基的组装和成熟。

3 RimP的结构和功能

核糖体成熟因子P（RimP），以前称为YhbC或P15a，基因长度为453 bp，编码由150个氨基酸组成的分子量为16.7 kDa的蛋白，该蛋白由3个α螺旋和8个β折叠组成［4］。RimP促进核糖体组装和成熟的作用最初是在rimP基因缺失突变体中发现的，在突变的细菌内，成熟且具有翻译活性的70S核糖体的数量减少，而游离的30S和50S亚基积累增多。重要的是游离的30S亚基显示出未成熟的特征，因为30S亚基中的rRNA是17S前体，而不是成熟的16S rRNA［5］。这些观察结果表明，作为一种核糖体成熟因子，RimP的功能是促进30S小亚基的组装和成熟。体外重构实验进一步发现RimP可提高大多数核糖体蛋白与pre-30S小亚基（30S小亚基前体）的结合速率，尤其是与16S rRNA 5’端结合的核糖体蛋白S5和S12，它们的结合速度分别提高2倍和6倍，即RimP对S12与pre-30S小亚基结合的动力学效应最大，但是其他核糖体蛋白质与16S rRNA 5’端的结合动力学没有改变，表明RimP的这些效应是特异的［4］。这两种核糖体蛋白质都是最后结合到30S小亚基，由此推测RimP也在30S小亚基组装和成熟的后期发挥作用。RimP促进S5和S12与30S亚基结合的作用也在体内得到了证实，从RimP缺失株分离出来的核糖体组装中间物中缺少这两种核糖体蛋白［6］。此外，还发现这些中间体的中心假结（与S5和S12结合的16S rRNA结构域）的形成受阻，推测作为30S亚基的后期装配因子之一的RimP是通过稳定中心假结来促进与S5和S12的结合。研究表明，在大肠杆菌中，RimP与S5和S12直接相互作用，而在耻垢分枝杆菌中，通过免疫共沉淀和串联亲和纯化发现RimP与S12存在相互作用，而与S5不存在相互作用［7-8］。

此外，RimP对细菌的生存和生长也很重要。研究发现大肠杆菌缺失rimP会导致生长缺陷，一个rimP缺失突变株（ΔrimP135）表现出温度敏感的生长表型，在30℃、37℃和44℃时，其生长速度分别比野生型菌株降低1.2倍、1.5倍和2.5倍，表明随着温度的升高，生长速度显著降低［5］。随着温度的升高，rimP缺失突变体中未成熟的16S rRNA、30S亚基和50S亚基也积累增多，而成熟的70S核糖体则减少，揭示rimP缺失突变体的生长缺陷是由核糖体组装和成熟受阻所致。进一步的研究显示，rimP缺失突变体的生长缓慢不能被其他已知的30S成熟因子如RbfA、RimM、Era、DnaK、YjeQ/RsgA或KsgA逆转，表明RimP的这种作用是特异的。肺炎链球菌中RimP的同源蛋白SP14.3的缺失导致无法生存，偶发分枝杆菌的RimP对其在较低pH值的酸性体外条件下的生存至关重要，肠炎沙门氏菌的RimP对其毒力也起着至关重要的作用［9-11］。

但也有研究发现rimP的缺失导致细菌的生长速度加快，因为rimP的缺失可以提高其他的依赖NADPH的生物转化活性，提高木糖醇的产生而加快生长速度［12］。

作为一种核糖体组装的辅助因子，RimP还可能影响翻译效率。RimP可能会引起密码子的误读，降低翻译的准确性。RimP的突变增强了MetK（S-腺苷甲硫氨酸合成酶）的表达和蛋白翻译的准确性，从而增加了抗生素的产量［13］。

4 Era的结构与功能

核糖体成熟因子Era（E.coli ras-like protein），又称为RbaA或SdgE，基因长度为906 bp，编码一种类似Ras的GTP酶（GTPase），与核糖体30S小亚基相互作用，并促进30S小亚基的成熟［14］。删除era的细胞提取物没有翻译活性，加入Era蛋白也不能恢复其翻译活性［15］。Era是一种双结构域蛋白，具有一个C端KH RNA结合域和一个N端GTPase结构域。KH结构域可识别16S rRNA的3’端反义SD（Shine-Dalgarno）序列附近的GAUCA核酸序列，并与之结合［16］。结合GTP的Era与pre-16S rRNA（16S rRNA前体）结合，改变pre-16S rRNA的构象，尤其是pre-16S rRNA头区的h23和h24螺旋的折叠，以利于RNases对其进行加工，并提高其他核糖体成熟因子的活性，如KsgA。KsgA使pre-16S rRNA的h45中相邻的两个腺苷残基甲基化［17-18］。16S rRNA的甲基化发生在其加工和成熟的后期，此时的30S小亚基还不具备翻译能力，待16S rRNA成熟，Era通过水解GTP将其释放。Era与pre-16S rRNA的结合可以阻止30S和50S亚基结合成为70S核糖体，提示Era是检测16S rRNA是否成熟的重要蛋白［18］。金黄色葡萄球菌era的删除导致成熟的30S小亚基数量明显减少于50S大亚基，70S核糖体数量也减少，表明30S小亚基的成熟受阻［19］。体外组装实验还发现Era可以将核糖体蛋白S9、S11、S5和S12的结合速率提高2倍，3’结构域蛋白S7、S10、S13、S14和S19等的结合速率也出现不同程度的提高［18］。

Era是一种高度保守的蛋白质，在原核生物和真核生物中具有多种作用，除了参与核糖体组装和成熟，还参与细胞周期调控和凋亡。Era是细菌细胞生存所必需的，通过耦合细胞生长速率和胞质分裂，在细胞周期调控中发挥重要作用。大肠杆菌的Era的表达受到抑制或Era的GTPase活性缺失，导致细胞周期中具有2个或4个类核的细胞分裂受阻。Era的完全删除对细菌是致命的，缺失Era的大肠杆菌出现生长受阻，无法进行细胞分裂［20］。

Era通过其GTPase/GTP结合域在凋亡信号通路调控中发挥重要作用，Era GTPase结构域的氨基酸取代突变可诱导HeLa细胞凋亡，并且可以被Bcl-2阻断。缺失C端的KH结构域，可以减轻Era突变体的凋亡，提示该结构域对Era功能的重要性［21］。

5 RimJ的结构与功能

核糖体成熟因子J（RimJ）基因是在1979年发现的位于大肠杆菌基因图谱的23.7分钟位置，长度为582 bp，编码一种由194个氨基酸残基组成的乙酰化酶，该酶特异地负责核糖体蛋白S5的Nα-乙酰化，促进核糖体30S小亚基的组装和成熟。蛋白质的Nα-乙酰化是由Nα-乙酰化酶（NATs）催化的，它将乙酰基从乙酰辅酶A转移到蛋白质N末端氨基酸残基的α氨基上［22］。这种乙酰化可以中和N端的正电荷，该效应也可能促进合成过程中多肽的正确折叠，还可能促进蛋白质与其他蛋白质或核酸的特异性结合和相互作用。Nα-乙酰化是真核生物中最常见的蛋白质修饰之一，发生在大约80%～90%的不同种类的蛋白上，大约50%发生在酵母中，但很少发生在原核生物或古生菌的蛋白上。细菌内蛋白的Nα-乙酰化是非常罕见的，目前发现在大肠杆菌中只有4种蛋白质：核糖体蛋白L7、S5、S18和延伸因子EF-Tu发生Nα-乙酰化，它们分别被大肠杆菌的3种Nα-乙酰化酶，即RimL、RimJ和RimI乙酰化［23］。研究发现在RimJ基因缺失的大肠杆菌中，核糖体蛋白S5未发生乙酰化［24］。

RimJ既是核糖体蛋白的修饰酶，又是核糖体组装因子［25］。研究发现在核糖体蛋白S5突变（G28D）的大肠杆菌中过表达rimJ时，会抑制与S5（G28D）相关的冷敏感，翻译保真度下降和核糖体生成缺陷。如果将S5（G28D）突变与rimJ缺失结合，会增强S5（G28D）菌株的生长缺陷表型，而且rimJ抑制基因的功能是独立于其乙酰转移酶活性的［24］。还发现乙酰化的S5与核糖体蛋白的结合速度比未乙酰化的S5快，表明当S5与含16S rRNA的pre-30S亚基结合时，S5已经发生乙酰化［26］。这种结合可以提高30S小亚基随后的重塑或避免一些无效的置换，从而促进组装过程。而且RimJ是在30S亚基成熟的中间阶段与S5发生结合，表明S5的乙酰化与RimJ的核糖体组装功能可能发生在核糖体组装的同一阶段。

RimJ还参与细胞对环境信号的反应，环境信号在调节致病基因表达方面起着重要的作用，它可能影响病原体在宿主中的定植能力和在外部环境中的生存。研究发现rimJ的缺失缓解了尿路致病性大肠杆菌在低温、营养丰富和葡萄糖环境下对菌毛基因papBA转录的抑制作用，但对fan、daa和fim操纵子的转录影响不大，表明RimJ在多种环境刺激下调节papBA的转录，并且是papBA转录的唯一负调控因子，此外，papI的转录也受到RimJ的调控［27］。

然而像许多rRNA修饰基因一样，rimJ不是大肠杆菌生存的必要条件，而且非乙酰化的S5同样可以完成核糖体的组装和成熟，这也说明核糖体蛋白的修饰可能有助于微调翻译复合物的结构和功能。此外，rimJ缺失株的生存能力表明rimJ的核糖体组装因子功能也不是必需的。表明大肠杆菌核糖体的组装和成熟可能有多条途径，当其中一条途径受阻时，可以利用其他途径完成核糖体的组装和成熟，从而补偿某些特定组装因子的缺失，提高细胞生存的可能性［28］。

6 总结和展望

在大肠杆菌中，每个细菌中大约含有多达15 000多个核糖体，生长快速的细菌每分钟可合成数千个核糖体［3］。说明细胞内核糖体的组装和成熟不仅是一个复杂和耗能的过程，还是一个非常快速的过程，导致使用分离纯化的方法来研究核糖体组装和成熟的过程中有哪些成熟因子参与以及作用机制的难度很大。此外，核糖体的体外组装需要特殊的温度和条件，如高浓度的盐、高浓度的镁离子等条件；而且，与细胞内高效率的组装相比，体外组装效率却很低，这也为通过体外组装来研究核糖体组装和成熟过程和机制带来困难。不过，随着研究方法和技术的发展，核糖体组装和成熟的过程，以及在此过程中核糖体成熟因子的作用机制终将揭示出来。

研究核糖体成熟因子的另一个难题是它们的功能可能是冗余的，因为一些核糖体成熟因子基因的敲除只会导致细菌生长速率减慢，但并不致死，表明这些核糖体成熟因子的基因对细菌来说并不是必不可少的，虽然核糖体是细菌生长和繁殖不可缺少的，而且核糖体组装和成熟过程还需要核糖体成熟因子参与。核糖体功能冗余的第二个体现是在某个核糖体成熟因子删除或突变的菌株中过表达其他核糖体成熟因子可呈现补偿效应，如Era突变的细菌中过表达KsgA可以恢复表型，RbfA的敲除菌株中过表达Era可以部分恢复其表型［18］。此外，除了与核糖体组装和成熟过程相关外，核糖体成熟因子还有其他功能，所以并不能确定其必须性是否与其作为核糖体组装因子的功能相关。不过，随着研究的不断深入，核糖体成熟因子的功能也终将揭示清楚。