安图地区松茸菌塘土壤理化性质及真菌群落多样性分析初报

孙丽媛，赵 远，王 丹，姜菲菲，赵潇颖，赵云冬

(北华大学医学技术学院，吉林 吉林 132013)

松茸(Tricholomamatsutake)又名松口蘑，为珍贵野生珍稀食药用菌，有“菌中之王”的美称，风味独特，且有抗肿瘤[1]、抗氧化[2]、抗疲劳[3]等功能.松茸主要生长于吉林、云南、四川、西藏等地，对环境及生物因素要求苛刻，生长缓慢，尚不能人工栽培，仅可半野生栽培[4].作为生长载体，土壤理化性质对松茸的生长有较为关键的影响[5].菌塘是由宿主根系、松茸地下菌丝及土壤三者共同构成的白色海绵状结构，是松茸生长发育的主要场所[6].菌塘内微生物参与物质循环和能量转换，对菌丝体生长发育及子实体的形成都起着决定性作用[7].早期分析菌塘内微生物主要应用微生物培养法[8]、Biolog微平板法[9]，但这两种方法仅可研究少量可纯培养微生物.另外，有将测定微生物膜磷脂脂肪酸或核酸的方法应用于菌塘微生物多样性研究，但磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid，PLFA)[10]生物标记法仅可分析微生物群落结构；PCR-变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)[11]则需要根据条带位置和数量分析土壤中的微生物多样性.近年来，因具有测序量大、速度快、可分析物种丰富度等优点，高通量测序技术被广泛应用于土壤微生物物种和群落多样性研究.

本研究采集吉林省安图地区的松茸及其生境伴生菌姬松茸(Agaricusblazei)、美味牛肝菌(BoletusedulisBull.：Fr.)菌塘土壤，基于高通量测序技术对比分析土壤真菌群落多态性及主成分，找出优势菌群，结合理化性质分析，探究松茸菌塘生态系统特性及环境生态因子对土壤微生态的影响，以期建立优化菌塘土壤微生物群落结构的途径，指导松茸原位保育促繁及人工栽培，为研究土壤微生态与作物互作机制打下良好的理论基础.

1 材料与方法

1.1 土壤样品采集

松茸、姬松茸、美味牛肝菌菌塘土壤样品于2020年8月采集于吉林省安图地区东明林场299林班(43°7′0.24″N，128°44′15.29″E)，海拔656 m.该地区为温带大陆性温冷气候，年均气温3.78 ℃，年均降水量752 mm.供试土壤为暗棕色森林土壤.

设置3个20 m×20 m重复样方，为避免假重复，样方间距离均大于25 m，且每个样方中至少有3个距离大于2 m的菌塘.发现松茸、姬松茸、美味牛肝菌后，去掉枯枝落叶等杂物，在其正下方用土钻采集3个菌塘矿质层约0～10 cm处的土壤，将样品装入无菌袋，立即低温带回实验室.去除样品中的石块、动植物残体过2 mm尼龙网筛，充分混合后采用四分法取出约500 g，分为两份，装入无菌封口袋，贴上标签，注明取样编号及名称(松茸菌塘土壤样品记为S，姬松茸土壤样品记为J，美味牛肝菌土壤样品记为N)，1份置于-80 ℃超低温冰箱保存，用于高通量测序；另1份经自然风干后研磨，依次过40目及80目筛，用于土壤理化性质测定.

1.2 土壤理化性质分析

菌塘土壤pH利用pH计测定(土水质量比为1∶2.5)；有机质(TOC)采用重铬酸钾外加热容量法测定；全磷(TP)采用氢氧化钠熔融法测定；全氮(TN)采用以硫酸钾-硫酸铜为加速剂的凯氏蒸馏法测定；全钾(TK)采用氢氧化钠碱熔火焰光度法测定；水解性氮(HN)采用碱解扩散法测定；有效磷(AP)采用盐酸和硫酸溶液浸提法测定；速效钾(AK)采用醋酸铵浸提-火焰光度法测定.

1.3 土壤总DNA提取、扩增及高通量测序

称取0.5 g土壤样品，采用磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒(天根)提取土壤总DNA，利用微量核酸蛋白测定仪测定DNA浓度及纯度，按比例计算后用无菌ddH2O稀释至1 ng/μL.

以稀释后的DNA为模板，采用真菌ITS1区通用引物ITS1F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′及ITS1R：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′，应用Bio-rad T100梯度PCR仪进行PCR扩增.反应总体积为30 μL，其中，2×Taq PCR Master Mix 15 μL，上游引物、下游引物(2 μM)各1.5 μL，DNA模板10 μL，无菌ddH2O2μL.PCR反应参数：98 ℃预变性1 min，(98 ℃10 s，50 ℃30 s，72 ℃30 s)循环30次，延伸72 ℃5 min，4 ℃保存.

PCR产物检测：5 μL产物点样于1.5%琼脂糖凝胶，电压85 V电泳85 min.利用紫外凝胶成像仪观察结果，Qiagen公司凝胶回收试剂盒切胶纯化.回收产物送至北京诺禾致源科技股份有限公司，使用Illumina NovaSeq 6000平台测序.利用Uparse(v7.0.1001)将所有样本具有97%一致性的OTU归并和划分，采用Qiime(Version 1.9.1)、Unite(v8.2)及MUSCLE(Version 3.8.31)等软件计算Chao1指数、Ace指数、Shannon指数、Simpson指数、Unifrac距离及构建UPGMA样本聚类树.通过R中corr.test函数计算物种和环境因子的Spearman相关系数并检验其显著性，用pheatmap函数进行可视化处理.

2 结果与分析

2.1 土壤理化性质

松茸、姬松茸、美味牛肝菌菌塘土壤理化性质测定结果见表1.由表1可见：在整体水平上，所有样品组间除TOC、TN、AP外，其余理化性质均不存在显著差异.美味牛肝菌菌塘土壤中TOC含量显著高，TN含量显著低，姬松茸与美味牛肝菌菌塘土壤组间AP含量存在显著差异.

表1 松茸、姬松茸及美味牛肝菌菌塘土壤理化性质Tab.1 Physical and chemical properties of shiro soil of Tricholoma matsutake，Agaricus blazei and Boletus edulis Bull

2.2 土壤真菌测序深度分析及数据质控

高通量测序双端序列reads拼接及过滤后，获得了929 123条Clean tags.聚类获得OTU后绘制稀释曲线，见图1.由图1可见：随着序列数的增大，真菌稀释曲线均基本趋于平缓，表明测序数据量合理，测序结果能够较好地反映土壤中真菌种群的真实情况.

图1松茸、姬松茸及美味牛肝菌菌塘土壤真菌稀释曲线Fig.1Fungal dilution curve of shiro soil of Tricholoma mat-sutake,Agaricus blazei and Boletus edulis Bull图2松茸、姬松茸及美味牛肝菌菌塘土壤真菌OTU数量关系Fig.2Relationship between the number of OTU in shiro soil microorganisms of Tricholoma matsutake,Aga-ricus blazei and Boletus edulis Bull

2.3 土壤真菌OTU分类

通过聚类共获得901个用于物种分类的OTU，松茸、姬松茸、美味牛肝菌菌塘土壤OTU数量分别为476、496和561.根据各样本(组)的OTU数目，通过Venn图呈现松茸、姬松茸、美味牛肝菌样品的OTU数量，见图2.由图2可见：菌塘土壤真菌三者共有207个OTU，松茸组特有125个，占26.26%；姬松茸组特有137个，占27.62%；美味牛肝菌组特有214个，占38.15%；其余为样品间两两共有.

2.4 土壤微生物Alpha多样性

分析松茸、姬松茸、美味牛肝菌菌塘土壤的α多样性，结果见表2.由表2可见：在丰富度上，各样本中Chao1、Ace以及Shannon指数均呈现N>J>S，描述菌群均匀度的Simpson指数亦呈现N>J>S.

表2 松茸、姬松茸及美味牛肝菌菌塘土壤真菌α多样性指数Tab.2 Alpha diversity index of shiro soil fungi of Tricholoma matsutake，Agaricus blazei and Boletus edulis Bull

2.5 土壤真菌系统发育学特征

将所得有效OTU经物种注释后，得到11门，44纲，106目，217科，352属，462种，根据最大似然法构建的丰度前100的菌属环形系统进化树见图3.由图3可见：丰度前100的菌属主要分布在梳霉门(Kickxellomycota)、捕虫霉门(Zoopagomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)、被孢霉门(Mortierellomycota)、毛霉门(Mucoromycota)、子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)7个系统发育进化树分支上.其中，球囊菌门和子囊菌门系统进化树相对比较复杂，在属和种水平上鉴定到的物种较多.

图3松茸、姬松茸及美味牛肝菌菌塘土壤真菌属水平物种进化树Fig.3Phylogenetic relationships of shiro soil fungi of Tricholoma matsutake， Agaricus blazei and Boletus edulis Bull at the genus level

图4松茸、姬松茸及美味牛肝菌菌塘土壤真菌群落在门水平上的分布Fig.4Distribution of shiro soil fungi communities of Tricholoma matsutake，Agaricus blazei and Bole- tus edulis Bull at the phylum level

2.6 土壤真菌组成

在门水平上，松茸、姬松茸及美味牛肝菌菌塘土壤样品排名前10的真菌组成及相对丰度见图4.由图4可知：第1优势门为担子菌门，土壤微生物相对丰度分别为88.70%、86.37%和65.94%；第2优势门为子囊菌门，相对丰度分别为7.45%、7.67%和9.23%；第3优势门为毛霉门，相对丰度分别为2.69%、2.52%和0.22%.由此可知，松茸菌塘土壤样品中担子菌门含量最多，且高于其他样品，为松茸生长优势群落.其余菌门相对丰度较小，由大至小依次为被孢霉门、球囊菌门、梳霉门、捕虫霉门和壶菌门(Chytridiomycota)、Rozellomycota、油壶菌门(Olpidiomycota)，它们的相对丰度范围在0.000 6%～0.45%，其中，捕虫霉门和油壶菌门为美味牛肝菌菌塘土壤特有.

在纲、目、科、属水平上，松茸、姬松茸及美味牛肝菌菌塘土壤样品真菌群落组成及相对丰度见图5.

图5松茸、姬松茸及美味牛肝菌菌塘土壤真菌群落组成与相对丰度Fig.5Composition and relative abundance of shiro soil fungal communities of Tricholoma matsutake， Agaricus blazei and Boletus edulis Bull at the class-genus leve

纲水平上，隶属担子菌门优势类群的伞菌纲(Agaricomycetes)相对丰度分别为85.50%、85.78%和65.57%；双担菌纲(Geminibasidiomycetes)相对丰度分别为2.99%、0.43%和0.21%.隶属子囊菌门优势类群的李基那地衣纲(Leotiomycetes)相对丰度分别为3.39%、3.87%和1.92%；散囊菌纲(Eurotiomycetes)相对丰度分别为2.33%、2.38%和2.40%；座囊菌纲(Dothideomycetes)相对丰度分别为0.85%、0.63%和2.23%；粪壳菌纲(Sordariomycetes)相对丰度分别为0.68%、0.54%和0.70%.

目水平上，占比位于土壤样品相对丰度前10隶属伞菌纲的共有5个类群，其中，红菇目(Russulales)相对丰度分别为28.25%、37.56%和42.76%；钉菇目(Gomphales)相对丰度分别为18.70%、0.008%和0.01%；伞菌目(Agaricales)相对丰度分别为23.02%、33.66%和2.55%；牛肝菌目(Boletales)相对丰度分别为0.29%、1.61%和9.35%；革菌目(Thelephorales)相对丰度分别为13.61%、6.01%和6.38%.隶属双担菌纲的双担菌目(Geminibasidiales)相对丰度分别为2.99%、0.43%和0.21%.松茸菌塘土壤样品中钉菇目、革菌目和双担菌目所占比例远远高于其他对照样品，红菇目和牛肝菌目低于其他对照样品.

从科及属层面来看，优势类群红菇科(Russulaceae)的松茸、姬松茸及美味牛肝菌根际土壤微生物相对丰度分别为28.25%、37.56%和42.76%；钉菇科(gomphaceae)相对丰度分别为18.7%、0.008%和0.01%；口蘑科(Tricholomataceae)相对丰度分别为7.78%、31.17%和0.08%；丝膜菌科(Cortinariaceae)相对丰度分别为14.74%、0.54%和0.18%；牛肝菌科(Boletaceae)相对丰度分别0.07%、1.27%和9.35%；双担菌科(Geminibasidiaceae)相对丰度分别为2.80%、0.37%和0.21%.从属水平来看，优势类群红菇属(Russula)相对丰度分别为8.59%、34.78%和19.23%；口蘑属(Tricholoma)相对丰度分别为7.78%、31.17%和0.08%；丝膜菌属(Cortinarius)相对丰度分别为14.72%、0.50%和0.18%；牛肝菌属(Boletus)相对丰度分别为0.07%、1.27%和9.35%；枝瑚菌属(Ramaria)相对丰度分别为18.70%、0.008%和0.01%；齿菌属(Hydnellum)相对丰度分别为7.75%、0.01%和0.008%.隶属伞菌目的枝瑚菌属和丝膜菌属以及隶属红菇目的齿菌属在松茸中相对丰度占比较高，其他对照样品中相对丰度几乎为0，表明这3种菌属与松茸生长呈正相关；红菇属和牛肝菌属相对丰度远远低于其他对照样品，表明这2种菌属的存在与松茸的生长呈负相关.

2.7 真菌优势属与土壤理化性质相关性

土壤理化性质与真菌丰度(属水平)相关性分析结果见图6.由图6可见：土壤理化性质与部分真菌之间具有显著或极显著相关关系，牛肝菌属与AK存在显著负相关关系，丝膜菌属与TOC存在极显著负相关关系.

＊.差异具有统计学意义P<0.05.图6土壤理化因子与真菌丰度(属水平)相关性Fig.6Correlation between soil physicochemical factors and fungi abundance (genus level)

3 讨 论

松茸子实体香味浓郁，具有较高的营养价值和药用价值.近年来，松茸需求量不断增大，而产量却不断减少.目前，仅有利用野生或人工栽培的赤松林接种松茸外生菌根真菌菌剂进行半人工栽培的报道，故寻找适宜松茸生长的生态环境，对于突破栽培技术瓶颈具有重要意义.

马大龙等[12]研究松茸生长地土壤酶活性和微生物量与土壤理化因子之间的相关性发现，土壤微生物可以加速土壤中有机物分解和养分积累；LI Qiang等[13]基于条形码焦磷酸测序法研究了在四川7个主要松茸产区采集的松茸子实体相关细菌，结果发现，松茸的某些土壤性质与细菌群落有显著的相关性；杨淑娇等[14]基于PLFA方法对高山栎和高山松林松茸菌塘土壤微生物进行对比分析发现，宿主森林类型不会改变松茸菌塘微生物群落结构.土壤作为载体，为松茸生长提供必要的营养元素，土壤内真菌影响植物根系代谢，而适宜的土壤理化性质对松茸生长起促进作用.因此，研究松茸菌塘真菌群落结构、土壤理化性质与松茸生长三者之间关系，对保障松茸产量和质量，科学管理松茸产区，指导人工栽培都具有重要意义.目前，应用新一代测序技术研究松茸菌塘微生态的较少，仍需进一步探索真菌多样性及群落结构与松茸生长发育的作用机制.

因地理条件特殊，安图地区松茸与可人工栽培的姬松茸和美味牛肝菌在同一环境下伴随生长.本研究测定了该地区松茸及其生境伴生菌土壤理化性质，运用高通量测序技术分析了土壤真菌群落和结构，并对二者相关性进行了分析.结果表明：松茸及其生境伴生菌菌塘土壤TOC、TN、AP含量均存在一定差异，美味牛肝菌菌塘土壤中TOC含量显著高，TN含量显著低，可能是由于美味牛肝菌中优势菌定植，引起土壤理化性质发生相应改变.高通量测序OTU聚类结果显示，松茸真菌均匀度最低，表明松茸菌塘具有特定的真菌群落特征.真菌门水平上排名前3的优势菌门分别为担子菌门、子囊菌门、毛霉门，其中，担子菌门松茸菌塘高于其他对照样品.隶属伞菌目的枝瑚菌属和丝膜菌属及隶属红菇目的齿菌属在松茸中相对丰度占比较高，其他对照样品中相对丰度几乎为0，表明这3种菌属与松茸生长呈正相关.红菇属和牛肝菌属相对丰度远远低于其他对照样品，表明这2种菌属的存在与松茸的生长呈负相关.JEONG Minji等[15]采用高通量测序技术分别在1 a中每4个月对同一地点松茸菌塘土壤真菌群落进行对比，结果发现，担子菌门是大多数样品的优势类群；LI Qiang等[16]采用高通量测序技术测序松茸寄生的水叶栎土壤，结果发现，子囊菌门为优势菌.以上两项研究结论均与本研究结论一致.PARK K H等[17]在韩国庆州对3 a间田间移植松茸后土壤真菌群落的动态变化进行了分析，结果发现，尖镰孢菌(Fusariumoxysporum)和三线镰刀菌(F.trincintum)与松茸生长呈正相关关系，与本研究结论不一致，原因可能是检测地区与本试验样地相隔较远.此外，本研究还发现，松茸菌塘土壤理化性质与部分真菌之间具有显著或极显著相关关系，牛肝菌属与AK存在显著负相关关系，丝膜菌属与TOC存在极显著负相关关系.

本研究样地位于安图地区，结合地域生长特点选取松茸及其生境伴生菌姬松茸、美味牛肝菌菌塘作为研究对象，但样品数量及样地数较少，后续应继续选取同时存在3种菌塘的样地采集样品进行深入研究.高通量测序技术较以往其他方法测序量大、覆盖广，但测序结果中仍存在一定数量的真菌未能被分类至属水平，因此，有待于在未来研究中选择更为科学全面的方法进行深入研究.