甘薯发酵技术研究进展

吴冬梅,赵 海,靳艳玲

(1.中国科学院成都生物研究所，四川 成都 610041；2.中国科学院大学，北京 100049；3.中国科学院环境与应用微生物重点实验室，四川 成都 610041)

甘薯,旋花科植物,别称甜薯、地瓜、红薯等,是生产价值第三重要的作物,对全球人类饮食的热量贡献排在第五位[1]。甘薯种植面积广,分布在世界上的100多个国家,这些国家大部分处于热带或亚热带,特别是在亚洲、非洲和太平洋地区,其中亚洲和非洲地区的甘薯产量占世界产量的95%[2]。甘薯的产量很大,在世界上种植的块茎类作物中,甘薯产量排名第二,年产量超过1亿t[3]。此外,甘薯还具有耐贫瘠、抗旱性强、增殖率高、生长周期短、病虫害发生率低等优势[4]。随着我国农业、工业和食品产业结构的优化和人民生活水平的不断提高,甘薯发挥着越来越重要的作用,它既能丰富人和其他动物的膳食结构,也能支持工农业发展[5]。

甘薯含有丰富的淀粉和糖类物质,是用于微生物发酵的理想原料。因此,生物发酵已成为开发甘薯功能性食品、食品添加剂和高蛋白质饲料的新途径,研究人员已利用甘薯和甘薯渣来生产生物能源、蛋白质、酶、有机酸、壳聚糖等重要生物质产品[6-7],甘薯发酵技术也迅速发展,愈渐成熟。

1 产乙醇

目前，全球环境压力越来越大,能源短缺问题愈发严峻,生物质资源的来源丰富、可再生且对环境的污染小,之于传统能源表现出强大的可行性和可塑性[8]。生物乙醇是应用范围最广的生物能源,它通常是通过发酵碳水化合物和纤维素物质得到[9]。在乙醇生产中,甘薯是一种廉价且广泛使用的可替代谷物和其他粮食的生产原料[10-13]。世界上绝大多数的乙醇都是通过生物发酵产生的,发酵过程是某些种类的酵母菌(如酿酒酵母)或细菌(如运动发酵单胞菌)在低氧条件下代谢糖并产生乙醇和二氧化碳[14]。

1.1 同步糖化发酵(SSF)

以甘薯为原料发酵生产乙醇一般采用传统蒸煮双酶法工艺,即将原料蒸煮液化后添加糖化酶进行糖化、接种菌种进行发酵,此方法具有淀粉糊化彻底、利于糖化等优点[15]。除了先糖化再发酵,同步糖化发酵法因其具有工艺简单、能耗低、发酵效率高、发酵终点的乙醇浓度高等众多优点而得到了广泛应用,使乙醇的生产成本降低了20%以上[16]。岳瑞雪等[17]以甘薯为原料，利用同步糖化发酵产乙醇,通过响应面法分析料水比、(NH4)2SO4添加量、初始pH值及其相互作用对乙醇发酵的影响,确定最佳工艺为料水比1∶3.1,(NH4)2SO4添加量0.65%,pH值为4.2。在此最优条件下乙醇发酵效率很高,达到了91.35%。

除了以上提到的单料发酵法,为了克服甘薯浓醪发酵存在固形物浓度增大、流动性差的问题,也有学者开发了甘薯与其他原料混合发酵的技术。朱英波等[18]选用甜高粱汁为拌料液,利用甘薯淀粉和甜高粱汁1 g∶4.5 ml混料同步糖化发酵生产乙醇,有效地避免了醪液黏度大带来的系列工艺问题,且因甜高粱汁内含有氮源,也将(NH4)2SO4用量减少至0.3%,此混料发酵工艺比单料发酵的能耗更低,发酵时间可缩短至36 h,乙醇体积分数达14.8%,但乙醇发酵效率略逊一筹,只有89.5%,可能与高底物浓度产生的渗透压有关。因此,要综合考虑乙醇发酵效率和生产能耗之间的经济平衡关系。

1.2 挤压膨化发酵

高温条件下淀粉糊化导致的淀粉分子溶出,可促进后续α-淀粉酶通过液化将淀粉分子分解为糊精和糖类供微生物生长代谢。因此,以甘薯为原料发酵生产乙醇一般会将原料先进行蒸煮液化,但蒸煮工序的耗能占整个生产过程耗能的25%～30%[19]。为减少能耗、降低成本,许多学者开发了替代工艺以实现淀粉的糊化,如借助挤压机螺杆的推动力使物料膨化。陆家禛等[15]利用挤压膨化工艺来代替高温蒸煮液化工艺,直接将甘薯干膨化、粉碎后进行糖化和发酵,得到的最终乙醇体积分数达到了14.92%,较传统发酵模式中的乙醇体积分数提高了3.07个百分点,实现了降低能耗、节约冷却用水。挤压膨化工艺在玉米、木薯等乙醇发酵研究中已经取得了良好效果,但在甘薯中的应用仅限于甘薯干,因为鲜甘薯含水量高、黏度大,所以挤压膨化工艺在鲜甘薯乙醇发酵领域的应用前景有待进一步研究。

1.3 浓醪发酵

乙醇发酵的潜力取决于发酵醪中甘薯的淀粉浓度,因此浓醪发酵表现出了一定的优势。以甘薯为原料进行浓醪发酵具有污水排放量减小、耗电量降低、需要的容器更小、生产成本降低和生产力提高等优点。此外,在甘薯浓醪发酵中采用同步糖化发酵能够缓解由于高浓度溶解糖释放导致的高渗透压,使溶解糖含量始终保持在适宜水平,保证了菌体的高生长速度,缩短了发酵时间,提高了甘薯发酵效率。所以在同步糖化发酵模式下,糖化速率由初始醪液中添加糖化酶的量来调节,通过影响发酵早期的菌体生长速率来决定发酵后期的菌体浓度,这也决定了甘薯发酵后期的剩余糖化速率。Shen等[20]采用含有260 g/kg葡萄糖(完全糖化后)的甘薯醪进行燃料乙醇发酵,发现在同步糖化发酵过程中添加0.8 g/kg(干物质重)的糖化酶时,酵母的生长速度和乙醇产率最高。最终结果是在64 h内可获得119.78 g/kg(体积分数15.07%)乙醇,相当于理论产量的90.16%,按乙醇最终浓度计算的平均产率为1.48 g/(kg·h)。但浓醪发酵除了会对发酵菌体有抑制作用,还存在副产物生成量大从而影响乙醇生产、对生物反应器和传输器的要求高等问题,尤其在夏天温度高时进行发酵,还得重点考虑传热问题,所以在实际生产中要结合考虑乙醇产率以及设备要求等各方面以确定是否采用浓醪发酵以及采用浓醪发酵时的淀粉最佳浓度。

1.4 降黏发酵

甘薯醪是完全没有流动性的半固体状物质,黏度超过了4×104mPa·s,而一般可进行管道传输的液体原料的黏度小于100 mPa·s。甘薯醪黏度高是因为其细胞壁中富含纤维素、半纤维素和果胶物质等具有高保水能力的多糖。在工业化生产过程中,原料的黏度过高会导致其传输、传热、传质速度减慢,淀粉水解不完全,影响发酵效率,发酵后的固液分离困难等问题[4]。另外,利用微生物进行甘薯发酵时,高黏度会造成局部温度过高,导致微生物的代谢活力变差,降低发酵效率[21]。高黏度对发酵的影响在浓醪发酵过程中尤为突出。

那么,在甘薯发酵生产乙醇时,如何降低料液黏度是关键的一个环节。现在已经投入应用的降黏方法有加水稀释法、物理化学预处理以及直接在发酵过程中加降黏酶这三种方法。加水稀释法是通过向发酵料液中多加水增加其流动性,虽然显著降低了料液黏度,但底物浓度变低会使最终乙醇浓度降低,导致在最终蒸馏乙醇时能耗升高,增加生产成本,所以加水稀释法只能作为一种降黏的辅助手段。物理化学预处理法一般也是与降黏酶联合使用。物理化学预处理的影响因素主要包括pH值、温度、时间和甘薯品种,物理化学预处理包括高温预处理、酸热预处理等[22]。降黏酶是植物细胞壁降解酶,包括木聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等,加入降黏酶后,甘薯细胞的细胞壁会被部分酶解,从而改变细胞的形态,减弱细胞保水性,降低醪液黏度,有利于后续的发酵[23]。降黏酶一般是在液化完成后加入,因为在进行糊化和液化后,有利于降黏酶与其靶位点的充分接触[24]。添加降黏酶是甘薯降黏处理的最佳选择,但目前酶成本过高限制了其规模化应用,开发更廉价的降黏酶以及不同降黏酶的复合应用是今后研究的主要方向。

1.5 预热后同时进行降黏、水解和发酵(P-SVHF)

P-SVHF发酵甘薯是指将甘薯先预热后研磨,然后同时降低黏度、水解和发酵,简化了甘薯生产乙醇的过程,更加节能。预热(糊化)时的温度通常是低于液化温度(≥85°C),整个发酵过程只有一次加热过程,与传统方法相比节能48%左右,且优化了发酵条件以后缩短了整个过程的时间。通过中心组合设计进行进一步的改进,发酵时间从24 h缩短到18～19 h,乙醇转化率提高到93%左右。此时的水解过程是冷水解,温度低于起始糊化温度。然而,水解比较困难,因为酶面对的是一个更紧凑的淀粉。因此,Cristiane等[25]采用专为降解颗粒状淀粉而研制的商品化酶制剂对甘薯淀粉进行水解,在低于糊化温度的条件下,促进了一定的颗粒膨胀,提高了水解效率。然后,液化、糖化和发酵阶段同时进行。Cristiane等也将生甘薯与预热甘薯发酵过程进行比较,实验结果表明预热甘薯发酵的乙醇产率较高,发酵时间较短,且预热后的甘薯有助于后续的研磨过程,生甘薯因其质地较硬是不容易被研磨的。

2 产氢气

以甘薯为原料还可以产氢气(H2),H2也是一种理想的清洁能源。氢气的高热值约为120 MJ/kg,是汽油(47.4 kJ/g)和生物柴油(37.0 kJ/g)的3倍和4倍,它与氧气燃烧产生的副产品只有水,不会造成环境污染[26]。

由于甘薯具有约50%～80%高淀粉含量(以干重计),以及含有产H2途径相关的重要微量元素,所以采用甘薯制氢表现出强大的优势。Lu等[27]采用Box-Behnken设计,响应面法对影响甘薯淀粉生物制氢的关键因素进行了优化。最终确定甘薯浓度、FeSO4浓度和初始pH值为显著影响因子。初始pH值6.05、甘薯淀粉质量浓度27.63 g/L、FeSO4质量浓度63.17 mg/L为产氢的最佳条件,产氢量高达3 501 ml/L,比其他原料发酵产氢量高出很多。

3 产乳酸

乳酸是一种有机酸,被广泛应用于医药领域、化妆品行业以及食品行业。同时,乳酸被认为是最有价值的生物基构建化合物之一,可以被转化为丙酮酸、1,2-丙二醇、乙醛、丙烯酸、2,3-戊二酮[28]。由于广泛的用途,乳酸的需求量在逐年增加,但是现在大多数关于乳酸生产的研究集中在使用纯的或容易发酵的底物,如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖或木糖,但利用这些纯材料的成本过高。甘薯作为一种廉价、可持续再生的原料,加上淀粉含量丰富,使其在乳酸发酵中得到广泛应用。

乳酸可以通过化学合成或微生物发酵产生,其中微生物发酵产乳酸得到了更广泛的应用,因为它可以生产纯乳酸,而化学合成则会产生其他物质,导致乳酸纯度不够高。目前,微生物发酵生产的乳酸约占世界乳酸总产量的90%[29]。

Winifred等[30]利用嗜淀粉乳杆菌以甘薯淀粉为唯一碳源发酵产乳酸,选择适应性和非适应性嗜淀粉乳杆菌来提高生产乳酸的效率。研究表明,乳酸菌的适应过程和pH值都是影响乳酸产量的重要因素,而在两种影响因素的比较研究中,发现乳酸菌的适应过程对乳酸产量的影响更大。对于20 g/L的甘薯淀粉培养基,在不控制pH值的条件下,适应菌的乳酸产量为11.20 g/L,而不适应菌的乳酸产量为7.10 g/L；在控制pH值的情况下,适应菌和非适应菌分别产生14.80 g/L和4.20 g/L的乳酸。几乎所有的甘薯淀粉都被适应菌在48 h内利用了,适应菌表现出可以在较短发酵时间内最大限度地利用淀粉生产乳酸。对于非适应菌,延长其发酵时间可能会导致乳酸产量的增加,但不利于潜在的工业应用。

除了直接利用甘薯淀粉发酵产乳酸,还可以利用被提取淀粉后的甘薯渣来发酵产乳酸。可利用鼠李糖乳杆菌直接进行甘薯废渣固体发酵产乳酸,能耗低,不仅降低了乳酸生产成本,提高了乳酸产量,还为薯渣的治理和利用提供了新的技术思路,减少了甘薯渣污染环境的影响[31]。薯渣中C、N元素比约为126∶1,C元素含量丰富,能为微生物提供充足碳源维持生长,但N元素相对匮乏,需要外加氮源才可进一步促进其生长代谢。鼠李糖乳杆菌发酵产乳酸过程中,由于乳酸不断积累、pH值不断降低,抑制了发酵过程,选用便宜且有效的中和剂CaCO3可以明显缓解产物抑制、促进乳酸发酵的进行。刘玉婷等[32]通过正交试验,综合考虑发酵效率、活菌数及成本等因素,经过实验优化,最终确立了最适薯渣发酵条件为：鼠李糖乳杆菌接种量10%、尿素添加量0.8%、纤维素酶添加量0.4%、发酵温度35℃、碳酸钙添加量 5%,在该条件下发酵效率可达(96.55±0.866)%,发酵醪中的活菌数达到了3.04×108CFU/g。该工艺不仅适于工业化生产乳酸,且操作简单利于推广,易于被广大甘薯淀粉加工农户利用。发酵薯渣产乳酸的关键技术点就在于外加氮源维持微生物正常生长,加入碳酸钙以维持pH值在一个稳定的范围,从而促进乳酸发酵。

4 产柠檬酸

柠檬酸是最重要的有机酸之一,广泛应用于食品、制药和其他化工行业。由于柠檬酸在多种生物技术领域的多功能性,目前对柠檬酸的需求量超过了其生产量。甘薯废料是潜在的大规模生产柠檬酸的可行原料,Aboyeji等[33]以廉价易得的甘薯皮淀粉水解物为原料,利用黑曲霉来进行深层发酵生产柠檬酸。经过实验得出,碳源(CS)、氮源(NC)、发酵时间(FT)和pH值这4个参数是影响柠檬酸产量最重要的参数,而七水硫酸镁(MS)和甲醇浓度(MC)对柠檬酸产量有抑制作用。在最优条件下CS(97.25%)、NC(1.25%,以硝酸铵为氮源)、FT(7 d)、pH值(6.5),经混合设计和响应面优化,得出每毫升水解液可产生约(4.36±0.06)mg的柠檬酸,比其预测的产量提高了135%。甘薯皮淀粉浓度是影响柠檬酸生产的最重要的积极因素,所以提高甘薯皮淀粉浓度是促进黑曲霉发酵产柠檬酸的关键。

5 产蛋白质

Zuo等[34]为了减少甘薯饮料工业产生的废弃物对环境的污染,将甘薯饮料生产后产生的大量富含水、淀粉、纤维素和少量蛋白质的残留物与花生壳工业废渣进行混合发酵,生产可作为动物饲料的蛋白质。他们采用混合底物作为自然培养基,在固态发酵条件下,对6株不同微生物的产蛋白质能力进行了评价,结果以米曲霉和枯草芽孢杆菌组合发酵的底物蛋白质含量最高。通过中心成分设计优化了米曲霉和枯草芽孢杆菌固态发酵富集蛋白质的工艺参数:米曲霉和枯草芽孢杆菌接种比例为1∶1,初始含水率63.7%,培养温度26.9℃,发酵时间67.5 h,最终发现了5条蛋白条带,增加了高分子量蛋白质的丰度,且发酵底物的真蛋白质质量分数为(15.58±0.99)%,比未发酵底物的真蛋白质含量提高2～3倍。粉碎后的花生壳可以调节甘薯饮料残留物的含水率,使基材疏松,以便更好地用于固态发酵。许多亚洲国家也已将甘薯废弃物发酵成家禽和反刍动物饲料,因此甘薯饮料残留物和花生壳的混合物作为动物饲料具有一定的可行性。该方法利用甘薯和花生工业废弃物来进行混合固态发酵,在节约资源降低成本的同时能生产大量的蛋白质,同时提高蛋白质丰度。

安文亭等[35]将乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌和霉菌4类10株菌的二级种子培养基按10%接种量接入已灭菌的甘薯渣固体培养基中,于30℃恒温恒湿培养箱培养72 h,发酵结束后65℃烘干,测定发酵产物中干物质、粗蛋白质、真蛋白质、粗纤维和氨基酸含量变化。发酵完成后发现产朊假丝酵母能明显改善甘薯渣营养价值,提高真蛋白质和降解粗纤维的能力,必需氨基酸总量和氨基酸总量分别提高了211.32%和154.78%。

单细胞蛋白是一些单细胞或具有简单构造的多细胞生物的菌体蛋白的统称,其生产原理是菌体在满足自身生长需要后,将外源氮转化为菌体蛋白。甘薯价格低廉,生产饲料蛋白质成本较低。利用微生物液态发酵技术生产单细胞蛋白,更便于工业化大规模生产、产品纯化及产品品质的提高。明红梅等[36]以甘薯淀粉为原料,利用热带假丝酵母生产单细胞蛋白。在经过优化的培养条件下收获的酵母细胞干重为10.35 g/L,蛋白质质量分数为51.36%,总蛋白得率为 5.32 g/L。这种生产模式,既能为甘薯的高值化利用提供一条新的途径,又能优化饲料中的蛋白质成分,缓解我国饲料中蛋白质含量较低的问题[36],但还应该继续优化实验条件,以达到更高的蛋白质得率。

6 产甘薯汁饮料、甘薯酒和甘薯醋

甘薯的营养成分与谷类和马铃薯相近,不仅含有丰富的淀粉和糖类,而且还是抗氧化化合物的天然良好来源,如维生素、多酚、花青素和类胡萝卜素等[37],它具有低脂肪、低热量、高膳食纤维含量的特点。此外甘薯也是一种药用植物,具有抗肿瘤、抗菌和抗氧化等药用价值[38]。因此,以甘薯为原料开发功能保健食品日益增多。

复合饮料是指利用某些酵母菌、乳酸菌或其他国家许可的菌种发酵得来的饮品,因其独有的营养成分、独特口感以及保健功能,越来越受到人们的青睐和推崇。紫甘薯含有丰富的色素、硒、多糖、植物蛋白、维生素和矿物质等多种营养成分,特别是在紫甘薯中发现了高水平的花青素和酚类化合物,具有很强的抗氧化活性[39]。冯金晓等[40]利用紫甘薯为原料,在单因素试验基础上,以感官评价为指标,通过正交试验优化了乳酸菌及酵母菌复合发酵紫甘薯汁的工艺,确定其最佳工艺条件为：紫甘薯汁添加量50%,白砂糖添加量8%,发酵剂添加量6%,酵母菌∶乳酸菌配比为1∶7。在此最佳工艺条件下,所得紫甘薯汁复合发酵饮料口感纯正,甜度适宜,风味良好。

紫甘薯酒中富含花色苷,花色苷具有较好的耐热性和耐光性,能够提高视觉灵敏性,抑制脂质过氧化,防止血小板聚集,维持血管正常的通透性,预防糖尿病以及抗肿瘤、抗氧化、抗突变、抗辐射和抗癌等多种生理功能。杨雅利等[41]利用紫甘薯经蒸煮糊化、液化、糖化处理后,添加酿酒酵母进行带渣发酵,发酵后过滤得到紫甘薯酒。利用单因素和Box-Behnken响应面试验优化得出酿酒酵母添加量为0.084 5%时发酵得到的紫甘薯酒风味品质最佳,酸涩味和谐,酒度为11.2°。而楚文靖等[42]认为带渣发酵使酒体香气不协调,带有较重的苦涩味,因此选用了清汁发酵,在甘薯液化、糖化、添加果胶酶酶解后固液分离获得清汁,再接入酿酒酵母进行发酵,产酒率达9.5 %,得到的酒体抗氧化性强,风味口感最佳。

甘薯醋是在甘薯结束酒精发酵后接种醋酸菌进行醋酸发酵得到的,可以有效地避免糖和脂肪等能量物质在体内的过度积累,促进血管软化,控制血液胆固醇水平,维持体内pH值平衡和正常代谢以及生理功能的稳定[43]。史经略[44]以紫甘薯为原料,液态发酵酿造具有保健功能的紫甘薯醋,为给醋酸菌提供底物(酒精),首先进行了酒精发酵,但酒精产量并不是越高越好,初始酒精含量过高时会抑制醋酸菌的生长,当酒精体积分数为7.25%、醋酸菌接种量为9.79%时，得到的紫甘薯醋酸度值最高,为6.73%。

7 展望

由于甘薯具有种植面积广、产量大、价格低廉、淀粉等营养物质含量丰富等优势条件,关于甘薯发酵的研究也就越来越多。认识到甘薯发酵技术瓶颈及进展情况,也有了继续改进改善的方向：继续选育高淀粉低黏度优良品种,提高甘薯营养品质；寻找更优的降黏酶复合酶,以提升降黏效果、降低降黏成本；选育可以同步水解甘薯淀粉和发酵的菌种,从而简化发酵工序，降低水解酶成本；除了甘薯富含的淀粉,还可以挖掘纤维素等成分的高效利用。这些问题需要我们进一步去探讨研究,以促进甘薯的高效高值化利用。