PCSK9与动脉粥样硬化的研究进展

逯朝阳，姚瑶，2，郭春玲,2 综述 杨滨，李保 审校

1.山西医科大学第二医院心血管内科，山西 太原 030013；

2.山西医科大学，山西 太原 030001

动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)是一种慢性进行性心血管系统疾病，其特征是大动脉内脂质和纤维成分的积累，是老年人最常见的死亡原因之一。脂蛋白代谢紊乱和炎症相关的机制一直是As研究领域的热点[1]。低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)作为血浆脂蛋白的重要组成部分，参与了As发生发展的过程，是As发生的主要危险因素[2]。LDL-C主要通过低密度脂蛋白受体(LDLR)途径从血浆中清除，LDLR 主要位于肝脏中，其升高在增强LDL-C 清除率方面发挥关键作用，并与降低心血管系统疾病的风险有关[3-4]。前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是前蛋白酶转化酶家族蛋白酶K 亚家族的第9 个成员，目前已证实，PCSK9可通过调节脂质代谢而影响血脂，主要是在细胞表面与LDLR 的表皮生长因子前体同源结构域A(EGF-A)相互作用，强力抑制LDLR水平，限制LDLR介导的脂蛋白摄取，使得LDL-C在血浆中堆积，参与As的发生发展[3，5]。PCSK9还通过其他多种途径参与As的发生发展，本文对PCSK9 作为重要调控因子如何介导As的发生发展，以及对试图通过干预PCSK9 来防治As的相关研究进行了综述与展望。

1 PCSK9概述与表达

PCSK9 基因于2003 年初首次被报道[6]，前蛋白是生物活性蛋白和多肽通过有限的蛋白质水解而获得的基本单位，前蛋白转化酶是一组丝氨酸蛋白酶，其特点是能够水解同源底物中的肽键并激活本身[7]。自1990 年以来，研究已经发现了8 种负责组织特异性处理分泌前体的哺乳动物前蛋白转换酶(PCs)，PCSK9则是前蛋白转化酶家族的第9个成员。

PCSK9 主要在肝、胸腺和脾脏、胰腺等中表达。在啮齿动物中，PCSK9 主要在成年肝细胞中表达，在小肠和肾脏中表达较少，在发育中的中枢神经系统中短暂表达[8]。在KIM 等[9]的研究中发现，PCSK9 与胸腺和脾脏CD4+T细胞群的改变有关，小鼠中PCSK9的缺失导致循环中IL-17 的减少和脾脏中Th17 细胞数量的减少。PCSK9 在胰腺中也控制LDLR 的表达，可能有助于维持适当的生理平衡，以限制细胞中胆固醇超载，而这种效应与循环PCSK9 无关，可能与局部产生的PCSK9有关[10]。

2 PCSK9与脂代谢紊乱

2003年前，已知的高胆固醇血症只有两种常染色体显性形式：家族性高胆固醇血症(FH)，由编码LDL受体(LDLR)的基因突变引起；家族性载脂蛋白-100(APOB-100)突变引起的载脂蛋白-b100缺陷(FDB)，该突变破坏了LDL与LDLR的结合。这两种疾病都会导致血浆LDL-C水平升高和动脉中胆固醇的积累，特别是冠状动脉(冠状动脉粥样硬化)。2003年，ABIFADEL等[6]发现PCSK9基因后，多项研究证实，PCSK9突变在显性高胆固醇血症中所占的比例远低于LDLR 和APOB突变，因PCSK9突变而导致高胆固醇血症的受试者中，仅有的临床试验发现与脂蛋白代谢相关，提示PCSK9主要在胆固醇代谢通路中发挥作用[11-13]。

已有证据表明，血浆脂蛋白a[Lp(a)]浓度与冠状动脉疾病发生密切相关[1，14]。Lp(a)是一种密度介于高密度和低密度之间的特殊脂蛋白，是一种类似低密度脂蛋白(LDL)的颗粒，含有载脂蛋白(a)(apoA)与载脂蛋白b(apoB)[15]。Lp(a)富含胆固醇，可以沉积于血管壁，促使动脉粥样硬化形成血栓，是冠心病的独立风险因子。LDL-C 主要通过LDLR 途径从血浆中清除。LDL-C 与LDLR 结合后，LDL 和LDLR 被内化到网格蛋白包覆的凹坑中，并在溶酶体中降解。当LDLR 被循环回细胞膜时，PCSK9与LDLR结合，介导LDLR在溶酶体中的内化和降解，减少LDLR的循环，进而减少血浆中LDL-C的清除[3，16]。此外，O'DONOGHUE 等[15]汇总了25 096 例患者参与傅里叶试验结果，在接受依洛尤单抗[evolocumab(一种PCSK9 抑制剂)]治疗48 周的患者测试血浆脂质后发现，Lp(a)和LDL-C 水平从基线到48 周后相比，百分比均有下降，变化呈中度正相关性，且Lp(a)和LDL-C 水平较低的患者发生主要冠脉事件的风险也会降低，由此证实PCSK9 抑制剂可以通过降低基线Lp(a)浓度减少主要冠状动脉疾病的发生。此外，载脂蛋白b(apoB)是除了高密度脂蛋白以外的其他脂蛋白的主要结构蛋白，起细胞识别和摄取LDL 的作用，PCSK9 的缺失降低了apoB 的生物合成率[17]。

除上述外，ASON 等[18]发现在CETP 转基因小鼠中，PCSK9抑制剂介导的动脉粥样硬化疾病程度的减轻需要LDLR和载脂蛋白e(apoE)的共同参与，增加肝脏LDLR的表达。TAVORI等[19]发现人PCSK9 也会在动脉壁内积聚，直接影响动脉粥样硬化病变的大小和组成，而不依赖于这种血脂和脂蛋白的变化，这些作用依赖于LDLR，但与apoE无关。

3 PCSK9与炎症

3.1 内皮细胞 内皮功能障碍和炎症是As早期发生和进展的关键。研究表明，凝集素样氧化LDL受体-1 (LOX-1)与氧化LDL (ox-LDL)在血管中结合，在内皮损伤中发挥重要作用，高水平的LDL-C，特别是以ox-LDL 形式出现的LDL-C，会通过激活LOX-1 增加细胞内活性氧应激(ROS)的产生，从而进一步加重内皮细胞内炎症的发展[20]。SUN等[17]证实，缺乏PCSK9 的诱导时，内皮细胞中TLR2、LOX-1、ICAM-1、CCL2、CCL7、IL-6、IL-1 蛋白、Beclin-1、p62和TRAF6 编码基因的表达会显著降低(＞4 倍)。此外，高脂肪饮食喂养的apoE 基因敲除小鼠，沉默PCSK9 基因可以在不影响其血浆胆固醇水平的情况下，直接抑制As血管炎症进程及抑制Toll 样受体4/核因子κB(TLR4/NF-κB)信号通路[21]。基于上述证据，有理由认为，在内皮细胞中，PCSK9可以通过除LDLR和apoE 以外的途径启动促进As 的进程，既可以激活目前已证实的LOX-1途径，又可以影响未明确的炎症因子调控途径，共同促进内皮细胞炎症的发生发展，启动并加剧As的进程。

3.2 单核/巨噬细胞 当血管中炎症发生时，单核细胞可浸润动脉粥样硬化病变部位，分泌大量促炎细胞因子，成熟为活化的巨噬细胞，加速动脉炎症和动脉粥样硬化进程。据报道，在动脉粥样硬化过程中起核心作用的为两种不同的巨噬细胞群体：促炎(M1细胞)和抗炎(M2细胞)[22]，其中M1 巨噬细胞表达多种促炎介质，如诱导型一氧化氮合酶、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素家族如IL-1、IL-6、IL-12和蛋白水解酶3。研究证实，PCSK9 与NLRP3/Caspase-1 的作用是相互的[23-24]，一方面，PCSK9 通过启动线粒体DNA (mtDNA)损伤，激活NLRP3 炎症小体信号(NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1 和IL-18)，进而诱导Caspase-1 依赖的焦解作用，同时在决定PCSK9 分泌方面，NLRP3炎症小体可以通过IL-1小分子细胞发挥重要作用，特别是在高脂肪饮食的情况下更为显著。但是PCSK9 与线粒体损伤、分裂或融合等，及其在巨噬细胞参与动脉粥样硬化的进程中的具体作用机制，目前该方面的研究尚属空缺，需要更多的实验结果予以补充。此外，NADPH 氧化酶是巨噬细胞产生活性氧(ROS)的一种独特的酶源，ROS 参与了肿瘤坏死因子α(TNF-α)介导的PCSK9 表达，进而调节清道夫受体(SRs)的表达[25]。SRs 是巨噬细胞摄取ox-LDL 的主要受体，巨噬细胞释放的PCSK9 具有生物活性，在DING等[26]实验中，TNF-α诱导的小鼠以剂量依赖的方式增加了PCSK9 和所有SRs 的表达，从而达到调控ox-LDL 的摄取。以上可见，活化后的单核/巨噬细胞中，PCSK9 确实有促进炎症发展的作用，同时炎症因子也在促进PCSK9 的表达，比如PCSK9 与NLRP3/Caspase-1，鉴于巨噬细胞有多种促炎介质表达，有理由相信其中还有更多作用机制值得去探究。总的来说，单核/巨噬细胞在动脉粥样硬化的发生发展中有着举足轻重的作用，尤其是可以表达多种促炎介质的M1 巨噬细胞，一方面，活化后的巨噬细胞可以释放多种促炎因子通过各种途径与PCSK9 有着交叉相互作用，两者相互影响，共同促进动脉粥样硬化的发展进程，另一方面，PCSK9 对巨噬细胞线粒体的影响也值得注意及进一步研究。另一项研究指出，PCSK9转导的丝氨酸/苏氨酸激酶25 (STK25)转基因小鼠的主动脉中巨噬细胞浸润水平更高[27]，且STK25 蛋白在主动脉各层均有表达，由此可见，STK25 在巨噬细胞炎症过程中起着不可忽视的作用，也进一步可以看到其在调节心血管疾病风险中或许可发挥关键作用，通过药物抑制STK25 功能可能为预防及治疗动脉粥样硬化提供新的可能性，STK25 在动脉粥样硬化过程中发挥作用所涉及的信号通路可以为进一步寻找相关的治疗提供思路。

3.3 血管平滑肌细胞 在血管平滑肌细胞中，PCSK9 受Toll样受体4-c-Jun氨基末端激酶/应激活化蛋白激酶(TLR4-SAPK/JNK)信号通路的调控[28]，而细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)、p38 或磷脂酰肌醇三激酶(PI3-kinase)通路则对其没有作用。TLR4 配体LPS可上调血管平滑肌细胞中PCSK9基因和蛋白水平，这是一个在炎症和代谢中重要的通路，血管平滑肌细胞来源的PCSK9 会降低单核细胞LDLR 表达，影响LDL-C/LDLR 介导的单核细胞趋化因子受体(CCR2)表达，而后者对细胞运动和As发生至关重要。另外，溶血磷脂酸受体4 (LPAR4)[29]在腺相关病毒表达PCSK9 会降低LDLR 水平的作用，在暴露于ox-LDL后，平滑肌细胞上调炎症标志物IL-6 和CD68 的基因表达，且在敲除该基因的细胞中，编码促生长因子-平滑肌肌动蛋白A2(Acta2)的表达在基线水平较低。其他研究表明，IL-17 可通过增强TGF-β信号通路和血管平滑肌细胞产生胶原来稳定斑块的形态，并且在有促炎因子IFN-α存在的情况下，伴随的IL-17 的增加可能会促进As，但是抑制PCSK9 表达在上述通路中所起作用还未有试验进行证明[30]。根据目前所有证据，有理由推测PCSK9 的升高会促进IL-6、IL-17、CD68、IFN-α等的表达，进而促进As的发生发展。

3.4 血管成纤维细胞 血管成纤维细胞是形成血管外膜的主要细胞，血管功能障碍曾一度被认为是血管的一个“由内而外”的过程，但目前有更多证据表明，病理条件下，冠状动脉外膜重构先于内皮功能障碍的存在，最终导致血管壁增厚和功能障碍[31]。新生内膜形成的部分特征是成纤维细胞转化为肌成纤维细胞后获得了迁移和增殖能力，表现为诱导细胞骨架蛋白如α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达和纤维连接蛋白等基质成分的过度合成和分泌，这些表型改变允许外膜成纤维细胞持续向腔内迁移，促进新生内膜的形成和内膜增厚[32]。转化生长因子-1(TGF-β1)可以调节细胞生长和细胞外基质的合成，在组织修复中起着核心作用[33]。所以诱导TGF-β的表达可能为外膜成纤维细胞成为肌成纤维细胞提供分化信号。另外，血管外膜成纤维细胞在血管紧张素Ⅱ(ANG Ⅱ)刺激下合成并释放内皮素-1(ET-1)，且释放的ET-1具有生物活性，ET-1可能通过刺激外膜细胞表明ETA受体促进胶原合成[34]。由于目前PCSK9与成纤维细胞炎症方面的研究还属空白，所以列出了以下猜测。REY等[35]研究表明，炎症发生时血管成纤维细胞产生大量的NADPH氧化酶衍生的活性氧(ROS)，参与成纤维细胞增殖，结缔组织沉积，可能还有血管张力，但特异性氧化还原敏感信号通路的参与导致细胞增殖尚不清楚。关于ROS，巨噬细胞部分也有提及，一方面其会参与TNF-α介导的PCSK9 表达，另一方面参与调节SRs 的表达，那么血管成纤维细胞来源的ROS是否有同样作用呢？此外，缺氧条件下，前脂肪细胞增殖显著增加，IL-6、MCP-1 mRNA和蛋白表达均显著升高，人硒蛋白P(SePP1)的表达量显著降低，与血管成纤维细胞共培养后，血管成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，迁移增加，Ⅰ型胶原表达升高[36]。由此可见，缺氧可脂肪积累，诱导前脂肪细胞炎症状态，导致SePP1表达降低，可能参与了As的发生发展。这项发现与平滑肌细胞炎症时的所涉及的炎症因子有不谋而合之处，是否这些炎症因子会共同作用于平滑肌细胞和血管成纤维细胞，同时接受PCSK9的调控呢。

弹性假黄瘤(PXE)是由ABCC6 突变引起的常染色体隐性疾病，以动脉粥样硬化和软组织钙化为特征。据KUZAJ等[37]研究发现，PXE成纤维细胞中胆固醇生物合成增加与PCSK9 水平升高有关，且ABCC6表达的增加伴随着胆固醇生物合成的诱导，据此可以推测ABCC6 在人体脂蛋白和胆固醇稳态中具有功能作用，但是具体机制还未有研究阐明。

4 调控PCSK9水平在治疗动脉粥样硬化疾病中的临床意义

PCSK9 作为动脉粥样硬化性心血管疾病治疗靶点的发现，使得抑制其作用的单克隆抗体被开发，而循环的肝脏来源的PCSK9 是单克隆抗体的主要靶点[10]。两种针对PCSK9的人单克隆抗体：依洛尤单抗(evolocumab)和阿莫罗布单抗(alirocumab)在临床应用最为广泛，SABATINE等[38]研究共纳入27 564例患者，证明了evolocumab在他汀类药物治疗背景下可以显著降低LDL-C 水平至30 mg/dL(0.78 mmol/L)，并且会显著降低心血管风险，同样，TAVORI等[19]研究共纳入25 096 例患者，观察使用48 周依洛尤单抗的患者发现，依洛尤单抗将冠心病死亡、心肌梗死或紧急血运重建的风险降低了23%。除PCSK9 的人单克隆抗体之外，一种名为Inclisiran 的新型的通过降低胆固醇从而治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的药物也即将问世，该药是一种化学合成的小干扰RNA(siRNA)分子，靶向于肝脏生成PCSK9，其降低LDL-C 的效果和降低心血管风险的潜力目前正在临床试验中[39]。除上述两类调控PCSK9 水平的药物外，WANG 等[40]对7030B-C5药理作用和分子机理进行详细研究后，确定其为一种潜在的小分子PCSK9抑制剂。

5 结语

PCSK9 虽然发现较晚，但不可否认它是As 中一个重要的信号调控因子。虽然临床试验已经证明PCSK9 是降低血脂和预防和治疗的As进展的生物靶点，但其生理作用尚不完全清楚。LDLR和apoE 介导的PCSK9对血浆脂质的影响是目前已被证实的，但是目前越来越多的证据表明，PCSK9是通过各种炎症因子的介导促进As的发生与发展，但其具体机制还未明确。希望通过本文的梳理可以提供新的思路去考虑PCSK9与As的关系。