内质网应激和自噬在骨骼肌再生中的作用研究进展

李春杰，江振洲

(中国药科大学药物科学研究院，江苏 南京 210009)

在日常生活中，由于机械创伤、超负荷、运动、毒素、肌肉营养不良或者其它疾病状态等原因，骨骼肌容易产生急性或慢性损伤。肌肉损伤后具有再生修复能力，肌再生由位于基底膜和肌膜之间的肌源性干细胞，即骨骼肌卫星细胞(muscle satellite/stem cells,MuSCs)介导，对损伤后完整肌肉功能的恢复至关重要。MuSCs在正常情况下处于静止状态，受损后，MuSCs被激活并快速增殖成为肌源性前体细胞(也称为成肌细胞)，成肌细胞在经历分化、迁移和融合后最终形成新的肌纤维以修复受损骨骼肌[1]。

内质网(endoplasmic reticulum,ER)是维持钙稳态以及蛋白质正确折叠、加工和运输的重要场所[2]。在多种生理病理条件下，ER稳态的破坏会导致未折叠/错误折叠蛋白质的堆积，进而引起内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。为了缓解ERS，恢复ER稳态，细胞启动未折叠蛋白质反应(unfolded protein response,UPR)[3]。ERS作为自噬的潜在诱因，能够代偿性诱导自噬，以清除积累的错误折叠的蛋白质[4]。近年来的多项研究发现，ERS和自噬被激活，且在MuSCs介导的肌源性再生过程中发挥重要的调控作用，对损伤后功能性肌肉的再生修复至关重要。本文主要针对近年来ERS和自噬在骨骼肌再生中的作用及研究进展做一综述。

1 MuSCs是骨骼肌肌再生的基础

骨骼肌损伤后的再生过程可分为三个阶段：①伴随着大量MuSCs激活、增殖的炎症阶段；②伴随着成肌细胞分化、融合形成大量多核肌管的再生阶段；③伴随着再生肌纤维成熟的重塑阶段[5]。骨骼肌损伤早期经历炎症反应，纤维结构被破坏，出现大量坏死以及炎性因子和炎性细胞浸润。肌再生依赖于MuSCs的激活和增殖，随后成肌细胞分化并最终融合为多核肌管。在肌再生后期重塑阶段，肌管经历肥大和重塑后生成成熟的肌纤维并恢复其收缩能力，对肌肉功能的完全恢复至关重要。

MuSCs介导的肌再生由一系列转录因子的顺序表达调控[6]。配对盒转录因子(paired box gene 7,Pax7)在静息状态下的MuSCs中表达，在维持MuSCs池自我更新以及防止细胞早熟分化中发挥关键作用[7]。肌源性调控因子(myogenic regulatory factors,MRFs)由肌源性分化因子(myogenic differentiation factor,MyoD)、肌源性因子5(myogenic factor 5,Myf5)、肌源性调控因子4(myogenic regulatory factors 4,MRF4)和肌生成素(myogenin，MyoG)组成，在肌肉发育和再生过程中发挥重要作用[8]。骨骼肌损伤后，大多数MuSCs激活后迅速增殖并成为成肌细胞，诱导Myf5和MyoD的表达，启动肌源性再生程序。在肌源性分化过程中，Pax7的表达下调，同时MyoG和MRF4的表达增加。最后，成肌细胞融合形成多核肌管，成肌细胞/肌管再与残存的肌纤维融合，成肌细胞/肌管之间也相互融合以修复受损的肌纤维。成肌细胞在经历分化迁移融合形成多核肌纤维的过程中，MyoD的表达下调，肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)开始表达。MyHC作为骨骼肌中一种重要的骨架蛋白，是肌纤维形成的标志蛋白[9]。此外，一小部分MuSCs在激活后保持自我更新并返回静息状态，保留了卫星干细胞的特征，进行缓慢分裂以维持MuSCs池[10]。在肌源性再生过程中，不同MRFs之间的相互协调决定了MuSCs的状态和命运。

2 ERS调控肌再生

在多种生理病理条件下，如Ca2+失衡、炎症、氧化应激、葡萄糖缺乏或缺氧，ER稳态会被破坏，导致未折叠/错误折叠蛋白质在ER腔内堆积，从而引起ERS。为了缓解ERS并恢复蛋白质稳态，细胞启动UPR[3]。UPR由3个信号分支组成，分别由3种ER跨膜蛋白启动：需肌醇酶1α(inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α)、蛋白激酶R样ER激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)以及激活转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)[3]。在非应激状态下，这些蛋白通过与一种重要的ER分子伴侣，免疫球蛋白重链结合蛋白/葡萄糖调节蛋白78(immunoglobulin heavy chain binding protein/glucose-regulated protein 78,BiP/GRP78)结合而保持在相对不活跃的状态。当ER管腔内由于错误折叠/未折叠蛋白质堆积而处于应激状态时，GRP78优先与错误折叠的蛋白质结合而与3种ER跨膜蛋白分离，导致3种跨膜蛋白寡聚状态发生变化而磷酸化激活。激活的3种跨膜蛋白进而级联激活下游信号通路，增加ER分子伴侣的表达，并降低蛋白质整体翻译水平，以缓解ERS并恢复细胞稳态[11]。

已发表的研究表明，ERS诱导的UPR途径在骨骼肌再生过程中发挥重要的调控作用。在成肌细胞分化过程中，ERS介导分化不全的成肌细胞选择性凋亡，有助于存活的成肌细胞更好的分化形成肌管。此外，PERK和IRE1α信号分支上的相关蛋白通过正向或负向调控肌源性再生中相关因子的转录，在骨骼肌再生过程中发挥着重要的调控作用。

2.1 ERS诱导分化不全成肌细胞选择性凋亡 成肌细胞分化过程中伴随着分化不全的成肌细胞的选择性凋亡，这对骨骼肌再生是必须的。在肌源性分化过程中UPR的ATF6分支以及caspase-12的活性增加，介导易受应激影响的成肌细胞选择性凋亡，而抑制ATF6或caspase-12则减少成肌细胞凋亡并抑制多核肌管的形成[12]。ERS诱导剂衣霉素(tunicamycin)和毒胡萝卜素(thapsigargin)诱导分化不全的成肌细胞选择性凋亡，使得存活的细胞更有效地分化为功能性肌管，优化骨骼肌再生[13]。Wei等[14]研究发现， miR-181a-5p能够激活ERS诱导的凋亡信号并促进肌源性分化，同时，thapsigargin也能够通过上调miR-181a-5p的表达水平，促进成肌细胞分化。

2.2 PERK信号分支调控肌再生 内质网应激发生时，激活的PERK磷酸化真核翻译起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α,eIF2α)，促进激活转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)翻译，增加ER分子伴侣的表达，缓解ERS[15]。ERS过于严重时，ATF4则诱导C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP/DDIT3)转录上调，促进细胞凋亡[16]。Wang等[17]研究发现，低强度体外冲击波通过激活UPR的PERK/eIF2α分支能够促进L6大鼠成肌细胞形成肌管，而PERK抑制剂GSK2656157则抑制了肌管的形成。最近的一项研究发现，在小鼠成肌细胞分化过程中，PERK/eIF2α/ATF4信号通路瞬时激活，而敲除PERK或使用GSK2606414可降低MyoD的转录和翻译水平，导致成肌细胞在诱导分化后保持未分化，甚至呈现圆形形态，表明UPR的PERK信号分支是肌再生的关键因素[18]。Xiong等[19]研究发现，在氯化钡诱导小鼠骨骼肌损伤后，MuSCs中PERK、IRE1α以及ATF4的mRNA水平升高，而敲除PERK抑制肌损后的再生修复，表现为MyoD、myogenin的表达减少、新生肌纤维数量和大小减少以及肌肉质量减少，表明PERK对肌损后再生修复至关重要。

PERK信号分支对肌再生似乎有双重调控作用。早期的一项研究表明，在小鼠成肌细胞分化过程中，p-PERK和p-eIF2α以及CHOP水平瞬时增加，CHOP的过表达通过直接抑制MyoD基因转录延迟了成肌细胞的分化；而敲低CHOP促进了成肌细胞的分化以及多核肌管的形成，表明CHOP的表达有助于维持卫星细胞干性，而CHOP的下调是成肌细胞激活进入肌源性分化程序所必需的[20]。Zismanov等[21]研究发现，eIF2α在静止MuSCs中为磷酸化状态，在MuSCs被激活进入肌源性程序时则迅速去磷酸化。使用小分子化合物Sal003抑制eIF2α去磷酸化可促进体外培养过程中MuSCs的自我更新；而诱导eIF2α突变体eIF2αS51A(S51位点磷酸化缺陷)的表达导致MuSCs激活，伴随着Myf5和MyoD的表达增加。该研究表明eIF2α的磷酸化是维持MuSCs静息状态所必需的，有助于MuSCs的自我更新，而eIF2α的去磷酸化是肌再生后期成肌细胞分化、融合形成多核肌管所必需的。Jheng等[22]研究也表明，eIF2α的磷酸化引起的翻译衰减可能通过减少MyoD的表达使肌发生受损。

2.3 IRE1α信号分支调控肌再生 IRE1α具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和核糖核酸内切酶(RNase)双酶活性，是启动UPR最保守的信号传感器[23]。在内质网应激期间，IRE1α通过二聚/寡聚和自磷酸化被激活，通过其RNase活性介导UPR的一个关键信号分支。活化的IRE1α能够促进X-box结合蛋白1(X-box-binding protein 1,XBP1)mRNA中26个碱基内含子特异性剪切。剪接的XBP1(Spliced XBP1,sXBP1)作为转录因子，增加多种ER分子伴侣的表达，从而驱动参与调节蛋白质折叠、分泌和ER相关降解(ER-associated degradation,ERAD)的主要UPR程序。此前，有报道称MyoD和myogenin能够调控XBP1的转录，表明XBP1和肌再生之间可能存在某种联系[24]。Jheng等[22]研究表明，XBP1作为一种转录因子，能够诱导肌再生相关蛋白的表达，调控肌管形成，在肌再生后期发挥重要作用。Tokutake等[25]研究发现，XBP1通过诱导细胞周期蛋白依赖性激酶5(cyclin-dependent kinase 5,CDK5)能够调控肌源性转录因子MyoD和MRF4的表达，在成肌细胞分化过程中起着关键作用；成肌细胞中IRE1α和XBP1的敲除显著抑制肌源性分化过程。最新的一项研究发现，在小鼠成肌细胞分化过程中，p-IRE1α蛋白表达水平增加，而敲除IRE1α诱导肌生长抑制素(myostatin)表达上调，从而导致成肌细胞分化、融合形成多核肌管的过程受阻；而IRE1α的过表达通过下调Myostatin的表达有助于控制肌管肥大和重塑[26]。该研究还发现，在心肌毒素诱导的小鼠肌损后再生过程中，p-IRE1α、p-eIF2α和GRP78蛋白表达水平以及XBP1 mRNA剪接增加，而敲除IRE1α导致急性肌损后肌肉再生受损以及Myostatin信号增强，表明IRE1α可能通过下调Myostatin参与调控骨骼肌损伤后的再生修复。IRE1α驱动的转录因子XBP1也可能负性调控MyoD的表达而抑制肌源性分化过程。研究发现，sXBP1的过表达通过激活一种负调控MyoD活性的转录因子即肌肉，小肠和胃表达因子1(muscle,intestine and stomach expresion1,Mist1)，抑制肌源性分化过程，导致成肌细胞在诱导分化后形成的肌管较小[27]。

总之，UPR的PERK和IRE1α信号分支在肌再生中扮演着双重角色，PERK和IRE1α信号分支上的相关蛋白可能通过正向或负向调控肌源性再生相关因子的转录促进或抑制肌再生。ERS相关转录因子能够调控多种蛋白质的表达或者降解，导致ERS对肌再生的调控不是单一的、绝对的，因此探讨ERS在肌再生中的具体作用还需要进行更加深入全面的研究。此外，目前有关ATF6信号分支在MuSCs功能和骨骼肌再生中作用的相关报道较少，还需要使用遗传小鼠模型进行进一步深入研究。

3 自噬调控肌再生

自噬是细胞内一种重要的分解代谢途径，通过清除细胞内受损蛋白质和/或细胞器或对细胞外各种应激作出反应，为细胞的重塑、再生和修复提供能量和必需原料，是细胞维持稳态的一种重要机制[28]。自噬是一个多步骤的连续过程，包括吞噬泡(通常是双层膜)成核、延伸、逐渐包裹需降解或清除的蛋白或细胞器等物质形成密闭的自噬体、并最终与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解内容物。自噬体清除后的副产物(核酸、氨基酸、脂肪酸)可作为细胞代谢所需能量来源、合成新的细胞成分或参与信号传导[29]。近年来，越来越多的研究表明，自噬参与调控MuSCs介导的肌再生，在MuSCs的稳态和功能的维持以及损伤后肌肉的再生修复中扮演着重要角色。

3.1 自噬调控MuSCs介导的肌再生 在多种类型干细胞的研究中发现，自噬在干细胞静止、激活、增殖、分化和自我更新中起关键作用[30]。有研究报道，随年龄增长MuSCs自噬缺陷，导致受损蛋白质和功能障碍细胞器的堆积，并最终导致DNA损伤和衰老，以及MuSCs衰竭[31]。诱导C57小鼠MuSCs的自噬可以避免衰老过程中MuSCs内损伤的积累，改善MuSCs的功能，恢复其再生能力；而敲除年轻小鼠MuSCs中自噬相关基因7(autophagy-associated gene 7,ATG7)则会导致MuSCs快速进入衰老状态，导致MuSCs的数量衰减以及功能障碍，从而导致肌肉再生缺陷。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是在能量应激情况下正向调控自噬的一种重要的激酶。在MuSCs的研究中发现，AMPK对MuSCs介导的肌再生至关重要[32-33]。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子P27KIP1能够响应AMPK而激活，参与调控自噬或凋亡，在应激条件下决定细胞命运[34]。White等[35]研究发现，AMPK/P27KIP1信号通路通过诱导自噬，对MuSCs的激活以及随后的肌源性再生过程至关重要。衰老过程MuSCs中AMPK/P27KIP1信号通路受抑制，导致自噬和增殖的减少以及凋亡和衰老的增加，并最终导致MuSCs功能障碍；而AMPK或P27KIP1的遗传或药理学激活，能够有效诱导自噬并恢复衰老过程MuSCs肌源性再生潜能。另一方面，有研究表明MuSCs激活、增殖时诱导自噬流，以满足MuSCs激活过程中代谢能量需求，而抑制自噬导致能量产生不足，MuSCs活化延迟[36]。Fiacco等[37]研究发现，心肌毒素(cardiotoxin,CTX)诱导C57小鼠损伤后第5天MuSCs激活阶段伴随着自噬水平的增加，用雷帕霉素(rapamycin)激活自噬可以增强MuSCs的激活和增殖，而用3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)抑制自噬则导致MuSCs的激活和增殖受损，结果表明自噬对MuSCs的激活和增殖至关重要。预先存在的结构和信号蛋白以及细胞器的降解是成肌细胞分化和肌管成熟所必需的。McMillan等[38]研究发现，体外成肌细胞分化的过程中自噬水平增加，3-MA处理或敲除ATG7抑制自噬，导致成肌细胞分化受损，表明自噬可能参与肌再生并在肌源性分化过程中起促进作用。Baechler等[39]研究发现，在成肌细胞分化过程中，自噬保护成肌细胞免受氧化应激和线粒体损伤，对线粒体网络重塑和肌再生至关重要。总之，这些研究表明自噬在MuSCs稳态和功能的维持以及MuSCs介导的肌再生中发挥重要作用。

3.2 自噬促进肌损后再生修复 骨骼肌损伤模型中对自噬和肌再生的研究表明自噬在损伤后功能性肌肉的再生修复中发挥重要作用。Nichenko等[40]研究发现，CTX诱导肌肉损伤后14 d，肌再生和肌肉重塑的关键过渡期，自噬体组装增强，而使用3-MA处理小鼠8周后再注射CTX造成肌肉损伤后发现，损伤后肌肉力量和线粒体功能恢复缺陷，表明自噬对损伤后功能性肌肉的再生修复以及功能失调线粒体的清除和重塑至关重要。Unc-51样激酶1(Unc-51-like kinase 1,Ulk1)是在应激条件下启动自噬所必需的激酶。Call等[41]研究发现，自噬相关蛋白在肌再生早期阶段显著、短暂的诱导，而自噬流在肌源性分化和肌再生晚期重塑阶段增加，骨骼肌特异性敲除自噬启动因子Ulk1，阻碍了肌肉损伤后力量的恢复。Fiacco等[37]研究也发现，在CTX造成的C57小鼠肌肉损伤模型早期代偿性肌再生阶段，自噬被激活，而3-MA抑制自噬则会阻碍肌肉的再生和修复，表现为受损5 d时更少、更小的新生肌纤维以及更强的炎性浸润。在多种自噬相关基因中，ATG16L是自噬的关键成分，它与ATG12和ATG5组装形成复合物，与吞噬泡融合并参与吞噬泡的延伸。Paolini等[42]研究发现，CTX诱导小鼠骨骼肌损伤后，与野生型小鼠相比，在损伤后3 d肌再生初始阶段，ATG16L1小鼠(ATG16L基因表达减少但未缺失)受损肌纤维密度增加，在损伤后6 d肌再生晚期阶段，ATG16L1小鼠新生肌纤维尺寸较小，表明ATG16L1小鼠损伤后再生修复受阻。You等[43]最近的研究发现，敲除ARHGEF3通过增强自噬促进小鼠肌肉损伤后的再生修复，而氯喹(chloroquine)抑制ARHGEF3敲除小鼠增强的自噬后，阻碍了敲除ARHGEF3诱导的肌损后肌肉质量和力量的增加。总之，这些研究表明自噬促进MuSCs介导的肌再生，对肌损后功能性肌肉的再生修复至关重要。

4 结语和展望

尽管在病理和生理过程中，ERS和自噬是细胞内相对独立的调控机制，但它们之间能够相互作用且有许多共同特征。在多种病理生理过程中，ERS诱导的UPR以及自噬能够清除积累的错误折叠的蛋白质，缓解ER管腔压力，是细胞维持稳态的重要机制。在体外和体内骨骼肌再生过程的研究中发现，ERS和自噬被激活，且在MuSCs介导的肌源性再生过程中发挥重要的调控作用，对损伤后功能性肌肉的再生修复至关重要。然而在骨骼肌再生过程中ERS与自噬的相互作用尚不清楚，有待进一步深入探究。