柔嫩梭菌灌胃的高盐饮食小鼠血清炎症因子及粪便肠道菌群、短链脂肪酸水平观察

雷超，刘聪，刘志华

1广州医科大学附属第五医院前沿医学交叉研究中心广东高校生物靶向诊治与康复重点实验室，广州 510700；2南方医科大学附属东莞医院肛肠科

中国人群平均摄盐量达12.5 g，显著高于世界卫生组织推荐（5 g）［1］。高盐摄入对免疫系统的影响是当前研究的热点［2］。高盐摄入与炎症反应之间的联系可能是多种疾病持续恶化的重要机制。研究发现，高盐摄入与肠道菌群失调产生协同作用，可进一步加重免疫紊乱［3］。柔嫩梭菌是寄生于人类肠道的益生菌，可发酵碳水化合物并产生短链脂肪酸［4-5］。研究显示，柔嫩梭菌在多种免疫性疾病中发挥抗炎效应，如支气管哮喘［5］、炎症性肠病［6］。本课题组前期研究发现，长期高盐饮食显著减少了小鼠肠道菌群中柔嫩梭菌的相对丰度［7］，而柔嫩梭菌对高盐饮食诱导的免疫紊乱的影响有待进一步探索。2021年1月—5月，本研究观察了柔嫩梭菌灌胃的高盐饮食小鼠血清炎症因子及粪便中肠道菌群、短链脂肪酸水平变化，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料SPF级雄性C57BL/6小鼠16只，6周龄，体质量19～20 g，购自广东省医学实验动物中心，于（22±2）℃恒温动物房、每天12 h光照条件下饲养。老鼠高盐饲料（8%NaCl）购自广东省医学实验动物中心。柔嫩梭菌购自美国模式培养物集存库（ATCC）菌种保存中心，接种于ATCC1490培养基中，并于含0.1% O2、10% CO2、10% H2和80%N2的厌氧箱中培养。白细胞介素（IL）1B、IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 动物分组及处理方法将16只小鼠随机分为实验组和对照组，每组8只。两组均给予高盐饲料喂养16周。实验组同时以柔嫩梭菌菌体悬液（109CFU/mL）2 mL每隔1 d灌胃，对照组以超纯水2 mL每隔1 d灌胃。

1.3 血清IL-1B、IL-6、TNF-α检测采用EUSA法。使用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，腹主动脉取血，收集血液于采集管中并置于碎冰上保存，随后4 000 r/min离心12 min得到血清。将两组小鼠血清依次加入ELISA检测用96孔板，分别加入抗小鼠IL-1B、IL-6、TNF-α，避光孵育30 min，PBS清洗。随后依次加入过氧化物酶标记的生物素化二抗、TMB和TMB终止液。最后用酶标仪测量450 nm处的光密度值，根据标准曲线计算对应样品浓度。

1.4 粪便肠道菌群检测采用高通量测序法进行16S rDNA基因V4片段的基因测序。收集两组小鼠新鲜粪便，置于标准冷冻管，液氮保存。样本检测由北京百迈客生物科技有限公司完成。提取粪便样本细菌总DNA，置于-80℃冰箱冻存。对DNA样品进行检测，根据全长引物序列合成带有Barcode的特异引物，进行PCR扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化，形成测序文库，质检合格的文库用PacBio Sequel进行测 序。PacBio Sequel下 机数据 为bam格式，通过smrtlink分析软件导出CCS文件，根据Barcode序列识别不同样品的数据并转化为fastq格式数据；将PacBio下机数据导出为CCS文件后，使用lima1.7.0软件，通过barcode对CCS进行识别，得到的Raw-CCS序列数据；使用cutadapt1.9.1软件进行引物序列的识别与去除并进行长度过滤，得到不包含引物序列的Clean-CCS序列；使用UCHIME4.2软件，鉴定并去除嵌合体序列，得到Effective-CC序列；将Effective-CCS用于Feature（OTUs、ASVs）、多样性分析、差异分析。

1.5 粪便短链脂肪酸定量检测由深圳微科盟科技生物公司完成。将两组小鼠粪便（约100 mg）解冻并悬浮，加入15%磷酸50μL、125μg/mL的内标（异己酸）溶液100μL、乙醚400μL进行匀浆1 min，然后以12 000 r/min离心10 min。将上清液通过0.22μm无菌过滤器进行过滤。随后取1μL液体进行GC-MS分析。

1.6 统计学方法采用SPSS25.0统计软件。计量资料以±s表示，正态分布的计量资料采用t检验，非正态分布的计量资料采用非参数检验（Mann-WhitneyU检验）。P＜0.05为差异有统计学意义。使用QIIME2软件分析肠道微生物群α多样性，α多样性指标包括Chao1、Ace、Shannon、Simpson指数。通过基于Bray-Curtis异质性的偏最小二乘法进行β多样性分析。使用Metastats软件比较两组细菌相对丰度，P值由非参数检验获得。对P值进行修正，获取q值，最后根据P值（或q值）筛选出两组样品组成差异的物种，默认P≥0.05。采用Metastats软件的LefSe分析比较两组细菌在属种水平的相对丰度，进一步通过线性判别分析（LDA）估计每个组成物种的丰度对差异效应的影响程度，将显著差异的对数LDA分数设定为4.0，找到丰度差异显著的物种。

2 结果

2.1 两组小鼠血清IL-1B、IL-6、TNF-α水平比较对照组血清IL-1B、IL-6、TNF-α水平分别为（524.0±55.4）、（159.4±7.2）、（1 875.0±438.0）pg/mL，实验组分别为（367.0±8.1）、（87.7±1.8）、（333.9±136.0）pg/mL。实验组血清IL-1B、IL-6、TNF-α水平低于对照组（P均＜0.05）。

2.2 两组小鼠粪便肠道菌群比较两组共检测出352个操作分类单元（OTU），其中两组共有243个OTU，两组间菌群丰度差异较大。对照组独有的OTU为36个，不受柔嫩梭菌灌胃影响；实验组独有的OTU为73个，为受柔嫩梭菌灌胃影响而产生的。两组的肠道菌群总体分布较为分散。见OSID码图1。实验组Chao1、Simpson指数高于对照组（P均＜0.05）。与对照组相比，实验组拟杆菌门及变形菌门相对丰度增加，而厚壁菌门及疣微菌门相对丰度减少（P均＜0.05）。见表1、表2。鼠乳杆菌显著富集于实验组，而机会致病菌木糖葡萄球菌、迟缓葡萄球菌显著富集于对照组。见OSID码图2。

表1 两组小鼠粪便肠道菌群α多样性指标比较（±s）

表1 两组小鼠粪便肠道菌群α多样性指标比较（±s）

注：与对照组相比，*P＜0.05。

组别实验组对照组n 8 8 Ace 201.5±10.5 163.3±19.1 Chao1 202.3±10.1*158.7±19.1 Simpson 0.92±0.0*0.75±0.0 Shannon 4.6±0.2 3.2±0.4

表2 两组小鼠粪便肠道菌群门水平比较（%，±s）

表2 两组小鼠粪便肠道菌群门水平比较（%，±s）

注：与对照组相比，*P＜0.05。

组别实验组对照组n 8 8拟杆菌门34.0±2.0*17.2±3.2厚壁菌门43.9±3.4*54.4±3.5变形菌门5.4±1.5*1.5±0.8疣微菌门6.8±3.2*25.4±4.6其他9.8±3.1*1.4±0.5

2.3 两组小鼠粪便短链脂肪酸水平比较GC-MS分析结果显示，实验组小鼠粪便丙酸、丁酸、异戊酸、己酸水平高于对照组，差异有统计学意义（P均＜0.05）。见表3。

表3 两组小鼠粪便短链脂肪酸水平比较（μg/mL，±s）

表3 两组小鼠粪便短链脂肪酸水平比较（μg/mL，±s）

注：与对照组相比，*P＜0.05。

组别实验组对照组n 8 8乙酸165.10±18.87 160.43±10.67丙酸22.65±2.55*11.15±1.96异丁酸0.96±0.05 0.69±0.16丁酸15.67±2.25*6.48±1.26异戊酸1.20±0.20*0.50±0.10戊酸1.30±0.31 0.71±0.07己酸0.24±0.02*0.16±0.01

3 讨论

饮食成分通过调节免疫稳态和肠道菌群组成影响健康，其中高盐饮食被认为与慢性炎症反应相关［8-9］。研究表明，高盐饮食可加重溃疡性结肠炎和自身免疫性脑脊髓炎等多种自身免疫性疾病的组织炎症［3，10］，可能机制是高盐饮食使巨噬细胞极化为M1表型并升高促炎介质γ干扰素的水平。一项对健康人群参与者的纵向研究发现，高盐饮食与促炎单核细胞比例存在显著的相关性［11］。高盐饮食诱导肠道菌群失调和代谢改变，诱发组织炎症［3，10］，因而人为补充缺乏的某种共生菌有望达到治疗自身免疫疾病的目的，这也是当前研究的热点。既往研究表明，高盐饮食可减少小鼠肠道菌群中的柔嫩梭菌相对丰度［7］。柔嫩梭菌是肠道中最具优势的三种细菌之一，现已发现其可维持肠道菌群稳态、促进免疫系统成熟、减轻炎症反应［12-13］。本研究发现，补充柔嫩梭菌后，小鼠肠道内该菌的相对丰度无明显增多，说明通过灌胃方式并不一定能促进柔嫩梭菌在肠道定植，另外也表明肠道菌群的高度复杂性。但高盐饮食喂养小鼠的血清炎症因子IL-1B、IL-6、TNF-α水平明显降低，表明机体免疫反应被抑制，机制尚待进一步研究。

高盐饮食小鼠的肠道菌群组成与正常盐饮食喂养的小鼠存在显著差异，其优势菌主要为厚壁菌门、毛螺菌科、瘤胃球菌科，而劣势菌种为拟杆菌门、乳酸菌属等［14］。本研究发现，两组小鼠肠道菌群总体分布明显不同，补充柔嫩梭菌显著增加了小鼠肠道菌群的多样性和丰富度，表明柔嫩梭菌可提升肠道菌群整体的稳定性。在门水平，补充柔嫩梭菌显著增加了拟杆菌门的相对丰度，并减少了厚壁菌门的相对丰度。厚壁菌门与拟杆菌门丰度比值增加不仅会影响机体的碳水化合物代谢，还被认为是与炎症过程相关的重要因素［15］。本研究结果表明，补充柔嫩梭菌能够改变这一炎症表型。本研究中，实验组鼠乳杆菌显著富集，对照组机会致病菌木糖葡萄球菌、迟缓葡萄球菌显著富集。鼠乳杆菌作为一种潜在的益生菌，是最常见的乳酸菌株之一［16］，其通过调节T淋巴细胞活性在维持肠道免疫稳态中起着重要作用［17］，在多种自身免疫性疾病中发挥抗炎作用［10，18］。上述结果表明，补充柔嫩梭菌可有效优化高盐饮食小鼠的肠道菌群构成，减少机会致病菌，增加益生菌相对丰度，从而纠正高盐饮食引起的肠道菌群相关炎症表型。

肠道中的短链脂肪酸主要包括丙酸、丁酸、己酸等，其含量受到饮食、年龄等因素影响，并在很大程度上受到肠道菌群构成的影响［19］。短链脂肪酸是肠道菌群和免疫系统之间交流的媒介。它们产生的信号通过游离脂肪酸受体在免疫细胞中传递，进而发挥免疫调节作用［20］。短链脂肪酸不仅在肠道内发挥局部作用，还可影响肠道免疫细胞，并通过炎症小体调节机体免疫反应［21］。本研究发现，实验组粪便中丙酸、丁酸、己酸水平显著高于对照组。已有研究发现，服用丙酸、丁酸可降低坏死性小肠结肠炎模型小鼠血清炎症因子IL-1B、IL-6水平。本研究结果表明，柔嫩梭菌灌胃显著增加了丁酸等短链脂肪酸水平，推测补充柔嫩梭菌可通过调节肠道菌群构成，影响短链脂肪酸代谢，从而发挥抗炎效应。