γ干扰素依赖性免疫应答在结核性胸膜炎中的研究进展

冯小红, 张璐璐, 薛庆亮

(1. 中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院 呼吸与危重症医学科, 甘肃 兰州, 730050;2. 宁夏医科大学临床医学院, 宁夏 银川, 750004)

细胞内病原体结核分枝杆菌(MTB)与其人类宿主长期共同进化，尽管人类的MTB感染率很高，但仅有少数感染者发展为活动性结核病，宿主免疫系统在疾病的发展和转归中发挥着关键作用。结核性胸膜炎(TP)是肺外结核的常见表现形式，也是淋巴细胞渗出性胸腔积液的常见病因。TP患者存在的主要炎症模式与辅助性T细胞(Th)1型免疫应答密切相关, γ干扰素(IFN-γ)作为活化的淋巴细胞分泌的重要效应因子在其中发挥着关键作用[1]。对IFN-γ依赖性免疫应答进行深入了解，有望为TP的诊断及治疗提供新的思路。

1 IFN-γ概述

1.1 IFN-γ的产生及信号传导

IFN-γ是具有抗微生物、抗肿瘤和免疫调节功能的多效细胞因子，主要由活化淋巴细胞产生，其受体在几乎所有细胞类型中普遍表达。作为Ⅱ型干扰素家族的唯一成员, IFN-γ本质是由IFNG基因所编码的蛋白质，具有生物活性的IFN-γ是由2个17 kDa多肽亚基以非共价形式结合形成的同型二聚体，在合成过程中，经过多次氨基末端糖基化修饰, 2个亚基以反向平行方式构成1个成熟的50 kDa分子[2]。Janus激酶(JAK)-信号转导和转录激活因子(STAT)途径是与IFN-γ密切相关的细胞内分子信号传导通路, IFN-γ通过激活胞内结构域分别与JAK1和JAK2相关联的IFNGR1和IFNGR2亚基组成的受体，刺激下游信号传导成分JAK, 活化的JAK蛋白诱导STAT1转录因子的磷酸化、激活和二聚化，新形成的STAT1同源二聚体易位至细胞核，与IFN-γ激活位点结合促进基因转录并介导多种生物学应答[3]。

1.2 IFN-γ与免疫细胞

IFN-γ是巨噬细胞的关键激活因子，可刺激巨噬细胞向M1促炎表型极化, IFN-γ活化的巨噬细胞上调抗原呈递和吞噬能力， 增加超氧自由基和一氧化氮的产生，增加促炎性细胞因子的产生及细胞内病原体的消除[4]。树突状细胞(DC细胞)作为功能最强的抗原呈递细胞，是T细胞免疫反应启动的关键。IFN-γ参与调节DC细胞的分化和成熟，还可以剂量依赖性方式降低DC细胞的存活率，在限制抗原呈递和防止T细胞过度活化及衰竭中起重要作用[5]。IFN-γ与CD4+T细胞相互作用刺激其向Th1型亚群分化，通过激活下游信号增加STAT1的活性及其转录靶T-bet表达, T-bet可上调白细胞介素(IL)-12受体和IFN-γ的表达，形成正反馈回路促进Th1细胞的分化[6]。T-bet还能通过抑制GATA3的活性限制CD4+T细胞向Th2和Th17分化[7]。IFN-γ在调节CD8+T细胞的增殖及细胞毒性效应中也发挥着重要作用，且IFN-γ还被发现能够抑制调节性T细胞的增殖及功能，但其具体机制尚待阐明。IFN-γ作用于B淋巴细胞可促进与吞噬细胞上的Fcγ受体结合的免疫球蛋白G(IgG)亚类的转换，激活补体，有助于吞噬细胞介导的微生物清除[8]。IFN-γ影响机体微环境中不同免疫细胞的行为，充当免疫细胞复杂关系的中间因子，在维持稳态方面发挥重要作用。

2 IFN-γ依赖性免疫应答与TP

2.1 IFN-γ与MTB感染

自然杀伤细胞(NK细胞)、黏膜相关恒定T细胞(MAIT细胞)、γδ T细胞等天然免疫细胞通过破坏受感染的细胞并分泌调节适应性免疫应答的细胞因子在抵御MTB感染的固有免疫应答中起核心作用。IL-2、IL-12对于NK细胞的活化具有重要调节作用，有研究[9]发现NK细胞分泌IFN-γ促进巨噬细胞活化并增加IL-12分泌，由此建立一个正反馈回路，形成有利于Th1型免疫应答的细胞因子微环境。作为获得有效T细胞免疫所需细胞因子的早期来源, MAIT细胞可从循环中募集至感染局部，通过直接识别微生物配体或在炎性细胞因子刺激下激活，分泌INF-γ、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等效应分子发挥免疫保护作用[10]。MTB可破坏巨噬细胞和树突状细胞的抗原呈递，从而绕过CD4+T细胞活化，而MAIT细胞优先响应先天性炎症信号，通过表达IFN-γ等细胞因子激活巨噬细胞并募集包括抗原特异性CD4+T细胞在内的其他免疫细胞，可能在规避MTB的免疫逃逸机制中起重要作用[11]。磷酸抗原特异性Vγ2Vδ2 T细胞仅存在于人类和灵长类动物中，其占人体循环中γδ T细胞总数的65%～90%, 具有响应MTB迅速增殖并产生Th1细胞因子和细胞毒性颗粒分子的能力，是感染期间主要的MTB反应性γδ T细胞，发挥重要的扩增和效应作用[12]。关于人类和灵长类动物的研究[13-14]发现，活化的Vγ2Vδ2 T细胞可被IL-2、IL-12、IL-15、IL-21等多种细胞因子显著扩增，其蓄积在感染部位以IFN-γ或TNF-α依赖性方式抑制细胞内分枝杆菌的生长，能有效降低MTB负荷及减少相关的肺组织病理改变。

CD4+T和CD8+T细胞亚群是适应性免疫应答的重要组成部分，在经历激活、增殖和分化后可迅速产生并分泌IFN-γ发挥细胞免疫作用。有研究[15]纵向比较了活动性肺结核患者口服抗结核药物强化治疗2个月前后表达IFN-γ的CD4+T细胞和CD8+T细胞的百分比，发现CD8+T细胞百分比无显著变化，这反映了CD8+T细胞在控制MTB感染中的可能作用，与分泌IFN-γ相比，其主要起细胞毒性效应的功能。GREEN A M等[16]通过小鼠过继转移模型试图确定除CD4+T细胞外其他来源的IFN-γ是否足以控制MTB感染，然而其数据表明CD4+T细胞分泌的IFN-γ对于机体获得长期最佳保护必不可少。也有报道[17]指出, CD4+T细胞介导的免疫保护可不依赖IFN-γ的产生，在没有IFN-γ刺激巨噬细胞的情况下, CD4+T细胞也能表现出很强的控制MTB生长的能力。GALLEGOS A M等[18]通过动物试验研究发现, CD4+T细胞在感染后3周的抗MTB效应功能可不依赖IFN-γ, 推测此过程中产生IFN-γ的其他免疫细胞发挥了重要作用，或者存在IFN-γ非依赖性保护机制，但需进一步研究验证。体内抗原特异性T细胞随时间推移的免疫应答机制，无论是IFN-γ依赖性还是IFN-γ非依赖性，均值得深入研究。

先天性和适应性免疫的不同细胞亚群在抵御MTB的不同时间发挥作用，而遗传缺陷可能影响多个效应T细胞亚群的潜在免疫作用。研究[19]发现, MTB的易感基因确实存在，即使暴露于弱毒分枝杆菌也会出现严重感染，这种特征被称为分枝杆菌病的孟德尔易感性(MSMD)。截至目前，临床已发现16种与MSMD相关的基因突变，而所有已知的遗传病因都会影响IFN-γ依赖性免疫应答。包括MARTNEZ-BARRICARTE R和CASANOVA J L等在内的研究团队[20]报道了MSMD的2个常染色体隐性遗传病因，即IL-12受体缺乏和IL-23受体缺乏。2020年该团队[21]再次报道了T-bet遗传缺陷导致的分枝杆菌病患者的研究结果，发现T-bet缺陷可影响天然免疫淋巴细胞的发育及IFN-γ的产生，而适应性淋巴细胞的作用并不能弥补这一缺陷。以上研究的结果均突显了免疫细胞抗MTB活性对IFN-γ的依赖性。

2.2 IFN-γ与TP的发病机制

TP发病通常被认为是明确的胸膜感染和胸膜腔区室内渗出性超敏反应共同作用的结果。胸腔积液产生的主要机制包括胸膜下结核病灶破裂进入胸膜腔，由MTB抗原诱发的炎症反应导致毛细血管通透性增加，蛋白质进入胸膜腔，局部高蛋白环境进一步加速胸腔积液形成; 其次，胸膜炎症可致壁层胸膜淋巴孔闭塞，减慢液体的吸收。MTB抗原进入胸膜腔会引起强烈的细胞免疫反应，最初的特征是多形核细胞和巨噬细胞的迅速涌入及富集，然后是NK细胞、γδ T细胞、Th细胞及其可溶性介质的积累[22], 此后是淋巴细胞驱动的长期免疫反应，伴随着腺苷脱氨酶的释放和肉芽肿的形成[23]。TP可驱动产生IFN-γ的NK细胞、γδ T细胞、CD4+T细胞等细胞亚群的明显效应反应，尽管外周循环中仅发现少量MTB抗原特异性T细胞，但其在感染部位却表现出惊人的富集，这种现象被称为“区室化”[24]。一项研究[25]通过流式细胞术测得TP患者胸腔积液的T细胞亚群中MAIT细胞的细胞频率为0.91%, 与外周血相比, MAIT细胞的功能在感染局部得到了极大增强。LI Z T等[26]研究发现, TP患者胸膜液单个核细胞中存在MTB特异性的CD3+TCRvβ11+NKT细胞，虽然数量显著低于外周血单个核细胞，但胸膜液单个核细胞中的CD3+TCRvβ11+NKT细胞可表达高水平的CD69、CD25, 表明其处于高度活化状态。感染局部IFN-γ差异表达提示了细胞运输和细胞因子表达的区室特异性模式，反映了产生IFN-γ的T细胞在疾病部位的活跃募集和克隆扩增，高度活化的具有抗原特异性效应的淋巴细胞聚集在病变部位发挥免疫效应[27]。

2.3 IFN-γ及γ干扰素释放试验(IGRAs)与TP的诊断

在众多引起胸腔积液的病因中, TP的诊断仍然具有挑战性。由于该病的贫菌性特征，仅有少数患者能获得明确的微生物学诊断，有时还需进行侵入性操作。定量胸水IFN-γ水平为TP的快速诊断提供了一种有应用前景的替代方法。一项荟萃分析[28]显示，非刺激胸水IFN-γ的诊断性能表现出与TP经典标志物腺苷脱氨酶(ADA)相当的总体准确性，展现出成为TP一线检测指标的潜力，随着对其临床合适阈值研究的深入，该方法可能得到更广泛的应用。

IGRAs通过量化T淋巴细胞响应结核分枝杆菌基因组差异区域(RD)-1编码的特定抗原刺激下释放的IFN-γ, 已成为检测结核感染的快速免疫诊断工具。目前，比较成熟的方法包括采用酶联免疫吸附试验的全血检测(QFT-GIT)和采用酶联免疫斑点技术的细胞检测(T-SPOT)2种。AGGARWAL A N等[29]系统地评估了基于血液和胸水的IGRAs对TP的诊断性能，均表现不佳。对此，有学者[30]提出疑问，其将TP患者的不确定结果归类为假阴性可能影响了准确性分析，其次2种检测的汇总分析可能导致整体IGRAs在体液中诊断性能较差。由于MTB抗原特异性淋巴细胞的“区室化”特性，评估基于胸水的IGRAs可能会提高诊断特异性。LUO Y等[31]的荟萃分析显示，胸水T-SPOT表现出较好的诊断性能，总体敏感性、特异性分别为0.91、0.88。TONG X等[32]也得到了相同结论，其还发现T-SPOT的性能优于QFT-GIT。总之，进一步优化胸水IGRAs操作并将诊断标准化，可能会使结果更加可靠。

2.4 IGRAs与TP的治疗监测

研究[33]发现，抗结核治疗过程中由MTB抗原诱导的细胞因子反应的变化可以反映宿主由于抗原负荷减少而产生的免疫学变化, MTB的细菌载量与IFN-γ对抗原的免疫反应程度存在关系。因此，一些研究试图通过IGRAs测量IFN-γ反应的变化寻找用于监测结核药物干预效果及评估疗程的生物标志物。CLIFFORD V等[34]发现，虽然通常IGRAs反应在抗结核治疗期间下降，但个体反应间存在巨大差异，故不建议使用当前的IGRAs监测患者的临床治疗。POURAKBARI B等[35]的系统评价研究同样没有观察到治疗前后QFT-GIT和T-SPOT的显著差异。ZHANG B Y等[36]通过随访TP患者抗结核治疗基线、第6个月、第9个月的QFT-GIT结果及T淋巴细胞亚群变化，发现QFT-GIT值与患者症状持续时间和年龄相关，而Treg细胞比例的动态趋势与不同时点IFN-γ反应波动相似，表明IFN-γ反应受宿主免疫状态影响，连续IGRAs可能不适合作为评估TP疗效的辅助手段。

新一代IGRAs, 即QFT-GIT检测的更新版本，称为QFT-Plus，包含1个旨在引起CD8+T细胞和CD4+T细胞反应的额外抗原管(TB2)。日本的一项研究[37]对招募的患者于抗结核治疗后第0、3和6个月进行QFT-Plus测试，第1个抗原管(TB1)的定量值表示CD4+T细胞反应，TB1和TB2的定量值差异替代CD8+T细胞反应，发现CD8+T细胞反应随着抗结核治疗时间的延长而下降。另一项在结核病低流行国家意大利开展的研究[38]也发现，抗结核治疗降低了响应QFT-Plus测试中抗原的IFN-γ反应。这些研究为QFT-Plus成为治疗期间的潜在辅助监测工具提供了有用的信息，未来还需进一步研究验证。

3 展 望

调控宿主免疫应答以治疗结核病的方法前景广阔，对宿主保护性免疫的本质及作用机制的深入研究是其核心所在。IFN-γ及诱导其产生、释放、作用及调节的相关细胞及细胞因子网络是一个复杂的信息传递系统，其相互作用及动态调节以达到适当的免疫应答水平。对微环境中各种免疫介质的研究有助于更好地了解TP的病理生理机制，寻找能在临床广泛应用并进一步拓展的细胞免疫反应相关指向性生物标志物，可为TP的早期诊断提供理论依据。深入了解IFN-γ依赖性细胞免疫激活及动态变化的具体机制，寻找刺激、扩展优势淋巴细胞亚群以及诱导、维持抗原特异性细胞频率的持久变化的信号通路，可为合理疫苗设计及治疗提供免疫靶标。