生物发光成像技术在肿瘤细胞活体可视化研究中的应用研究进展

陈 丹，王文静，王庆雅，曾 鋆，詹勇华

(西安电子科技大学生命科学技术学院分子与神经影像教育部工程研究中心，陕西 西安 710126)

1 生物发光成像技术在活体可视化研究中的应用进展

生物发光成像技术(Bioluminescence Imaging，BLI)是一种可以在活体内利用生物光信号关联特定生理或病理细胞活动，实时跟踪监测细胞、蛋白质甚至基因动态变化的分子成像技术。采用这种非侵入式技术可以在同一动物、同一空间和时间条件下定量细胞进程，检测动物体内生物大分子的动态变化[1]。

小动物活体BLI通常采用荧光素酶报告系统。将荧光素酶报告基因置于目标基因启动子的控制之下，是构建荧光素酶报告系统常采用的方法。利用组织特异性甚至活性严格依赖于某个特定蛋白的启动子，可以在小动物体内根据荧光素酶的表达情况追踪某一细胞进程或跟踪该特定蛋白的转录活性。另一种方法是克隆荧光素酶基因的cDNA到靶基因位点上。与上述方法不同，这种方法可以做到可视化靶基因的表达，而不是其蛋白活性的变化。这两种方法都可以实现活体内生物学进程的实时无创成像。此外，成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR 相关蛋白(Cas)技术的出现为荧光素酶基因插入到目的基因位点提供了更简便的方法。到目前为止，通过BLI进行细胞活动研究的小动物模型中，使用最多的是小鼠模型。近几年，也开始出现斑马鱼模型的BLI研究报道。

萤火虫荧光素酶在荧光素酶报告系统中应用最为广泛，它是一种热不稳定酶，半衰期约为2 h，可用于生物过程的动力学研究[2]。表达萤火虫荧光素酶的器官和细胞摄入底物荧光素时，荧光素酶可以利用ATP作为能量来源，在氧气存在的情况下催化荧光素发生氧化反应形成氧化荧光素，同时发出生物荧光。而且，动物体本身不会产生荧光素，需要依靠外源摄入才能引起荧光素酶的催化反应，所以荧光素酶报告系统在动物体内没有背景干扰，具有极佳的信噪比。在小鼠模型中，外源荧光素可以通过腹腔注射的方式进入体内并迅速分布全身，甚至穿过包括胎盘在内的血液组织屏障[2-3]。对于斑马鱼模型而言，荧光素通过腹腔注射或溶解在斑马鱼活动的水体中，都可以达到理想的效果[4]。除了萤火虫荧光素酶外，还有许多其他荧光素酶也可以作为报告系统应用于活体BLI。这些荧光素酶来源不同，催化底物也不尽相同，有D-荧光素、腔肠素和腔肠素类似物furimazine[2]。被麻醉的动物在吸收了外源荧光素酶底物后，放置在不透光的暗盒中，当动物体内荧光素酶催化底物并产生生物发光反应时，安装在暗盒中的电荷耦合设备成像系统(CCD)将捕捉荧光素酶反应中产生的光信号，通过计算机采集图像数据，分析软件将电子信号转换成数值，并最终形成图像。最开始，大多数此类设备只可以生成二维图像结果，直到三维漫射发光断层成像(DLIT)设备被开发出来。DLIT设备考虑了光在组织中的散射和吸收，并可进行光源的3D位置和亮度的估算，从而获得检测动物的3D图像结果[1-2]。

BLI技术的灵敏度受许多参数的影响，其中一个关键的影响因素是动物体内荧光素酶标记细胞的深度。荧光素酶催化底物产生的光虽然具有较强的穿透能力，能够穿透小型动物模型的组织，但是有研究发现每多1 cm的组织深度，光强就会降低10倍。Signore等[1]还发现小鼠体表毛皮上的色素沉着也会降低生物发光值，不过采用去除体表毛发或者选取白化小鼠品系的方式，可以减小这一误差。而对于斑马鱼模型而言，由于其体型小而无毛，与其他动物相比更有利于体内生物发光穿透组织到达皮肤表面。此外，BLI技术的灵敏度还受到调控荧光素酶表达的启动子活性强度和细胞转基因效率的影响。不仅如此，成像系统中所使用的CCD相机也是调节灵敏度的一个重要变量。

从伦理学角度来看，活体小动物BLI采用了非侵入式成像的方法，可以在不伤害和牺牲小动物的情况下达到实验目的，并极大程度上减少了所需实验动物的数量。

2 BLI转基因小鼠模型应用进展

作为一种功能强大的无创分子影像技术，BLI技术可以在活体生理环境中监测单个生物大分子的行为。在过去的十年里，这项技术的应用已经从对解剖结构的静态观察扩展到对分子事件的动态分析。在肿瘤研究中，BLI与肿瘤模型相结合，为实时追踪肿瘤进展相关的分子事件提供了新方法。利用BLI技术，可以在转基因肿瘤小鼠模型中可视化肿瘤的生长和肿瘤相关的细胞活动，如肿瘤增殖、存活和侵袭以及细胞炎症和免疫反应。这些基于荧光素酶成像的转基因小鼠模型(GEMM)不仅可以用于示踪活体内生理和病理过程，还可以检测抗肿瘤化合物的治疗效果。

2.1 显示细胞生长的报告基因小鼠模型 细胞周期的异常往往会导致肿瘤的形成与发展，与细胞增殖调控有关的生物大分子的可视化动态分析无疑可以帮助大家更好地理解细胞生长过程中的各种活动。2012年Goeman等[5]报道了一个真核生物核因子(NF-Y)依赖性启动子调控的荧光素酶报告基因GEMM，该模型中每个处于细胞周期中的细胞都会表达荧光素酶，结合BLI技术既可以观察到小鼠体内正常的细胞增殖区域，也可以观察到肝损伤后细胞再生过程中NF-Y的活性。这项研究也表明此类小鼠模型可用于研究参与细胞增殖的基因功能和疾病发病机制中的异常增殖过程。它们也将有助于开发新的抗增殖和促增殖药物，用于评估药物在靶组织和非靶组织中的效果。此外，该研究团队也已经成功地将这一可跟踪细胞增殖的小鼠模型运用于长期监测小分子药物在骨髓和脾脏细胞增殖过程中的效果[5-6]。

为了监测细胞衰老和恶性转化的早期阶段，由p16INK4a蛋白编码基因和荧光素酶报告基因组成的多种转基因系统被构建出来[7-9]。p16INK4a属于细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶的抑制蛋白，对细胞周期蛋白复合物的活性起负调控作用。除此之外，p16INK4a还可促进细胞衰老以应对诸如癌基因激活这样的应激情况。最早相关的报道是构建了一种表达人类完整的p16Ink4a和荧光素酶融合蛋白的GEMM[7]。随后，Baker等[8]构建了由2617 bp的p16INK4a蛋白编码基因启动子片段调控的荧光素酶报告基因GEMM。之后又将荧光素酶基因靶向敲入到内源性p16INK4a蛋白翻译的起始位点，使荧光素酶基因位于p16INK4a蛋白编码基因的开放阅读框内，并且保留了已知的顺式调节元件[9]。以上三个转基因报告系统都能够监测衰老和肿瘤发生的早期阶段。此外，荧光素酶基因敲入p16INK4a的GEMM还被用来研究环境因素对衰老的影响[10]。

2007年Ohtani等[11]建立了由p21蛋白编码基因部分启动子片段调控的荧光素酶报告基因GEMM，用来检测基因毒性应激下细胞周期在时间和空间上的变化。在此之后，Tinkum和Mcmahon等[12-13]采用基因敲入技术，将荧光素酶置于内源性p21蛋白编码基因启动子的控制之下，从而构建了GEMM。Tinkum等[12]还通过p53基因缺陷小鼠与该GEMM进行杂交，证实p53是p21蛋白编码基因的启动子诱导荧光表达所必需的。事实上，这两组研究表明外源性和内源性p21蛋白编码基因的启动子都受到p53的调控[11-12]，这使得这两种模型不仅能在体内监测p21Cip1活性，也能监测p53的激活。

p53蛋白是细胞应激时中止细胞周期进程的关键因子。利用p53依赖性的mdm2和Puma启动子调控荧光素酶基因，可以构建两种用于监测p53转录活性的报告基因GEMMs[14-15]。鉴于p53在正常细胞和细胞恶性转化过程中都有着重要作用，p53报告基因GEMM也将成为帮助药物研发领域研究者们预测、追踪和表征药物不良反应的有力工具。

2.2 示踪肿瘤相关炎症和免疫反应的小鼠模型 2002年，Carlsen等将核因子-κB(NF-κB)反应元件插入到荧光素酶基因的上游调控区域并建立了GEMM。NF-κB转录因子在众多生理和病理过程的炎症反应中都起着关键的调控作用[2，16]，这使得由NF-κB反应元件诱导的荧光素酶报告基因GEMM可以作为示踪活体内炎症反应的理想工具。利用这一模型可以实现体内很多组织促炎反应和抗炎反应的成像研究，如胰岛B细胞和心脏移植、心肌梗死、大肠杆菌性乳腺炎等[2]。最近，有报道构建过表达肿瘤坏死因子(TNF-α)和由NF-κB反应元件驱动荧光素酶的GEMM[17]，生物发光成像显示过表达TNF-α可有效激活小鼠模型中NF-κB荧光素酶表达，从而为筛选靶向TNF-α/NF-κB信号通路来治疗炎症和多种自身免疫疾病的潜在药物提供评估工具。早在2006年，Ishikawa等[18]将荧光素酶基因敲入内源性环氧合酶2编码基因的起始位点，构建了两种GEMM来监测慢性和急性炎症反应。除此之外，也有学者利用其它参与炎症反应相关过程的基因，用它们的启动子驱动荧光素酶报告基因并构建GEMM，如Smad3/4依赖性启动子、人IL-1β、CXCL8、nestin和NFκb2。2015年，Hayashi等[19]将荧光素酶基因整合到带有人白细胞介素6基因序列的细菌人工染色体上，构建了一种可以敏感地监测炎症反应的GEMM。但是上述这些GEMM都是用于监测全身各种健康或受损组织中的炎症反应，未能在肿瘤相关炎症研究中发挥作用。

关于可视化肿瘤相关炎症反应的研究相对较少。Rauch等[20]选择了两种GEMM的杂交后代作为实验模型来研究自发性淋巴瘤。两种GEMM杂交的后代小鼠可自发产生白血病和淋巴瘤，利用BLI可追踪其体内细胞恶性转化相关的炎症反应信号，有助于研究与肿瘤发生有关的炎症步骤。利用这一模型，该研究团队还证实了炎症刺激可以引发淋巴肿瘤[21]。

尽管富有挑战性，科学家们也依然在不断努力尝试构建各种可视化GEMM来观察体内免疫反应的相关过程。2018年，Szyska等[22]选择活化T细胞核因子(NFAT)编码基因启动子调控的萤火虫荧光素酶基因以及组成性启动子调控的海肾荧光素酶基因构建了双报告基因GEMM。该模型可以用来监测肿瘤引起的T细胞激活，并进行相关的动态分析。利用叉状头/翅膀状螺旋转录因子P3(Foxp3)蛋白编码基因的启动子控制荧光素酶和白喉毒素受体基因，从而构建的GEMM也是一种免疫反应的可视化模型[23]。还有一种用于免疫反应的可视化GEMM，是利用人T细胞表面抗原CD4编码基因连接荧光素酶报告基因构建而成的[24]，也可以作为研究肿瘤免疫学的有力工具。

3 肿瘤细胞活体可视化研究进展

基因工程小鼠肿瘤模型是研究肿瘤发生相关分子机制的有力工具。结合非侵入性的BLI技术，携带生物成像报告系统和人类肿瘤的GEMM可以用来观察特定的肿瘤细胞进程和被标记的分子事件，为肿瘤早期检测以及认识肿瘤起源、免疫系统作用、肿瘤血管生成、肿瘤侵袭和肿瘤治疗等相关研究提供帮助。近年来，许多研究利用BLI技术监测GEMM体内肿瘤的生长。这些GEMM能够模拟高死亡率肿瘤进程，包括脑癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌和肝癌等[2，25]。

2002年，Vooijs等[25]首次构建了肿瘤发光小鼠模型，用来研究脑垂体肿瘤的发生。他们利用携带条件突变型Rb蛋白等位基因的小鼠和在垂体特异性启动子驱动下表达Cre重组酶和荧光素酶的小鼠杂交。杂交后代小鼠产生的垂体肿瘤携带荧光标记，有助于开发靶向Rb通路的防癌抗癌药物。随后，又有研究团队利用调控细胞周期和凋亡的相关转录激活因子E2F1的启动子-荧光素酶转基因(Ef-Luc)小鼠与人胶质瘤GEMM杂交，建立少突胶质细胞瘤模型，通过BLI技术实时观察少突胶质细胞瘤的发展[26]。

采用前列腺特异性启动子构建的荧光素酶GEMM可以用来监测前列腺恶性肿瘤的发展和转移。2006年，Lyons等在诱导形成的小鼠前列腺增生和肿瘤细胞转移模型的基础上，利用前列腺上皮细胞特异性表达的抗原(PSA)编码基因的启动子调控荧光素酶基因表达，实现了长期追踪雄激素阻断对前列腺肿瘤生长的影响[27]。同年，Seethammagari等[28]利用PSA启动子调控荧光素酶构建了可以用来监测前列腺肿瘤发光以及肿瘤转移的GEMM。2017年，有报道将共表达表观遗传调控因子的核心成分(EZH2)蛋白-荧光素酶小鼠与携带Probasin-Cre系统的小鼠杂交，获得EZH2蛋白与荧光素酶在前列腺特异性表达的GEMM，可长期监测前列腺肿瘤的生长和潜在转移[29]。

荧光素酶GEMM也为肝脏和淋巴肿瘤研究提供了新方法。2011年，Lu等[30]利用内源性甲胎蛋白(AFP)启动子驱动胸腺嘧啶激酶和荧光素酶报告基因，构建了基因敲入小鼠。同年，Park等[31]也报道了一种利用AFP启动子调控荧光素酶表达的转基因小鼠。这两种小鼠模型都可以通过BLI技术监测化学诱导产生的肝癌[30-31]。还有研究者采用Cre重组酶介导的基因敲除技术构建特殊的荧光素酶小鼠模型，其肝脏肿瘤中可检测到生物发光信号[32]。通过BLI技术，也可实现胰腺T细胞肿瘤和B细胞淋巴瘤的无创监测，观测位于淋巴结和肝的肿瘤转移[33-34]。

在胰管腺癌(PDAC)的基因研究和病理研究中同样使用到了荧光素酶标记的GEMM。Manni和他的研究团队构建了两种小鼠模型，其中荧光素酶报告基因会在增殖细胞中表达，从而实现在活体内可视化PDAC的增殖过程，为长期跟踪PDAC的发生和发展提供了直观的可视化的研究方法[35]。

为了可视化追踪活体肿瘤中小分子化合物，2014年Zhong等[36]利用他莫昔芬诱导Cre重组酶系统，构建了在上皮细胞中致癌基因和荧光素酶基因共表达的口腔肿瘤小鼠模型，可用于监测口腔肿瘤的发展，模拟临床上小分子和图像引导放射治疗的反应。

在乳腺癌可视化和活体监测研究中，BLI技术也应用广泛。2012年，有报道利用MMTV启动子调控荧光素酶和多瘤病毒中型T抗原在乳腺中表达并构建GEMM，实现了乳腺肿瘤进程的可视化研究[37]。Δ16HER2基因是人表皮生长因子受体2(HER-2)编码基因的剪接变异体，在小鼠模型中采用MMTV启动子调控荧光素酶和Δ16HER2基因的表达，可监测活体内Δ16HER2基因介导的乳腺肿瘤的发生，探索Δ16HER2的功能[38]。此外，也有研究团队利用实体肿瘤往往形成乏氧微环境的特点，开发出能够对乏氧区域进行响应成像的GEMM。随后，利用这一小鼠模型与乳腺肿瘤转基因小鼠杂交，实现在数周内对肿瘤的生长进行纵向跟踪，评价药物治疗的效果[39]。与之同时，Jia等[40]报道了一种可监测乳腺肿瘤早期发生过程中人源端粒酶逆转录酶(TERT)编码基因表达水平的荧光素酶GEMM。早在2003年，《Nature Medicine》上开创性地报道了使用未产生性激素的幼鼠和去除卵巢的成年小鼠构建的荧光素酶GEMM，该模型中荧光素酶报告基因的表达受到雌激素受体反应元件的调控，可用于观测雌激素受体活性在乳腺癌恶性转化过程中的动态变化[3]。2016年，Vantaggiato等[41]利用上述小鼠模型诱导散发性乳腺癌，结合BLI技术从肿瘤早期阶段到触诊阶段对雌激素受体的活性进行成像追踪。

如今，一些融合型GEMM也被应用于BLI成像，如Vegfr3小鼠模型，这一类小鼠体内转入了内源性血管内皮生长因子受体3(VEGFR3)基因启动子调控的EGFP-荧光素酶融合蛋白，诱发该小鼠形成乳头状瘤，便可跟踪监测乳突淋瘤诱导淋巴管的生成。此外，荷兰的研究团队为了通过BLI技术观测自发形成的肿瘤负荷，构建了一种广泛表达的条件性荧光素酶转基因小鼠模型，随后利用该小鼠与在肺上皮细胞中表达条件性致癌基因并可诱发非小细胞肺癌的转基因小鼠杂交，最终实现了无创示踪活体内肺癌的发生发展过程[2]。

4 斑马鱼模型在基因表达实时成像研究中的应用进展

人们发现尽管人类和斑马鱼的进化分歧发生在4.5亿年前，但两者在控制信号传导、增殖、分化、凋亡等相关分子信号通路上仍然高度保守。因此，在细胞培养基础实验和人类临床试验之间，也有研究采用斑马鱼模型来探索恶性疾病的治疗效果。因斑马鱼胚胎具有光学透明的特性，常用绿色荧光蛋白标记并在其整个胚胎中分析缺陷或病理表型，研究疾病的发展过程[2]。而等到斑马鱼成年后，会逐渐失去这一特性，从内部器官发出的荧光信号会在穿透表皮时被削弱，影响观察，使得在成年斑马鱼中检测荧光蛋白变得比较困难。如果采用BLI技术，由于不需要外部光源，背景噪声信号弱，荧光素酶反应的发射光波长也足以穿透成年斑马鱼的所有组织，则可以克服这一困难。

不过与小鼠模型相比，利用BLI技术构建的荧光素酶转基因斑马鱼模型依然很少。2013年，Chen等[4]首次实现了转基因斑马鱼的体内生物发光成像，其构建的心肌细胞分化因子(cmlc2)启动子调控的荧光素酶斑马鱼转基因模型还可以用来估测内脏和心脏中的肌肉量，纵向追踪损伤后的心脏再生。还有研究在泛素启动子调控荧光素酶全身成像的斑马鱼转基因模型中提取带Luc标记的成年斑马鱼造血干细胞，再将其移植到普通斑马鱼品系中。随后，通过BLI技术非侵入性地跟踪斑马鱼中移植的造血干细胞，观察其植入和归巢过程，从而筛选增强细胞归巢能力的小分子化合物[42]。此外，利用NF-κB启动子片段驱动荧光素酶和GFP蛋白编码基因，构建双向报告基因斑马鱼模型，可以实现体内外NF-κB转录因子表达变化的实时监测[2]。目前，BLI技术主要还是应用于斑马鱼异种移植瘤模型中，通过用荧光素酶标记的癌细胞来跟踪体内肿瘤的生长，评估抗肿瘤和抗血管生成化合物的疗效[43]。

5 荧光素酶成像缺点

如前所述，BLI在临床前研究应用中具备许多优势，但是在分析成像结果上该技术仍存在一定局限性。首先，BLI只能进行半定量研究，无法做到绝对定量，难以规范化和标准化。生物发光信号值也并不完全与细胞数量成正比，荧光素酶与底物反应的各个步骤都可能受到内源性和外源性因素的影响，导致误差的产生，甚至在不同的细胞或组织内荧光素酶、荧光素以及ATP等辅助因子的数量都存在着差异[44]。其次，不同种荧光素酶的半衰期和稳定性介于几小时至几天之间，使用分泌型荧光素酶时，血液和尿液的某些循环成分也会影响到酶的稳定性[45]。再加上动物体内表达荧光素酶细胞的深度和位置都会影响BLI信号的采集，导致目前BLI技术的应用仅仅局限于小型动物。此外，底物的给药途径也是影响BLI成像效果的关键因素之一。研究发现静脉和腹腔注射后底物在动物体内的生物分布状态不同，静脉注射使底物在组织间分布更均匀，而腹腔注射则可延长器官摄取底物的时间[46]。

在动物体内，荧光信号的淬灭是由色素分子(如血红蛋白)介导的，并且与信号源的深度有关。动物的毛发和皮肤也会分散和衰减荧光信号，尤其是黑色皮毛。实验证实与白鼠相比，黑鼠发射出的荧光信号更低[47]。还有一点，虽然BLI技术由于动物荧光背景低而具有高灵敏度，但有的底物，如腔肠素，在不存在酶的情况下其自生发出的光又会增加荧光背景[2]。

6 结 语

肿瘤作为一种全身性的疾病，早在一个多世纪以前就已经被人类关注，并开展了广泛的研究。近十年来，对于肿瘤发生和发展过程中宿主体内大环境的调控机制逐渐受到众多学者的重视。例如，一些新出现的证据强调了肿瘤进展过程中宿主体内造血功能的时空激活和免疫反应[48-49]。事实上，肿瘤组织和淋巴通路之间也有着极其复杂的相互作用。在管腔乳腺癌(LBC)细胞存在下的体内环境会促进一些原本为惰性的肿瘤细胞弥散性生长。LBC还会分泌激活骨髓间充质细胞(BMC)的细胞因子，由此产生的级联反应进一步促进了腺癌的生长，而使用阿司匹林等抗炎化合物可以抑制BMC的激活，阻断该级联反应。这些研究说明宿主体内系统大环境在肿瘤进展中起重要作用[49]。然而，系统大环境与肿瘤组织靶点之间通路的作用方式尚未被阐明，仍有一些重要的问题亟待解答，对这一方面的研究也需要建立一系列可以实时跟踪肿瘤进展的相关模型。

BLI技术与报告基因动物模型的出现彻底改变了包括肿瘤在内的生物进程的研究方式。通过活体无创监测生物发光信号，可以在目标器官上或是整个动物体内实现生物大分子的可视化研究，实时显示分子事件。该模型的非侵入性成像，可以帮助追踪单个实验动物体从胚胎到成年的生理进程事件，并进行肿瘤进展和药物反应的纵向研究，从而大大减少了每个实验环节所需的动物数量。BLI技术与报告基因动物模型也可以呈现出由于个体之间的差异而导致的实验结果变化。迄今为止，BLI技术与报告基因动物模型已经在肿瘤基础和应用研究领域取得了重要成果，相信在未来它们将能够更广泛地应用于肿瘤转化、药物开发和毒理学等研究和应用领域。