猪非典型瘟病毒（APPV）研究进展

张 恒，左媛媛，戈胜强，张 会，宋桂才，吴晓东

（1.山东信得科技股份有限公司，山东青岛 266104；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；3.青岛韦立国际集团，山东青岛 266000；4.山东诸子生物科技有限公司，山东潍坊 262204）

2015 年美国科研人员Hause 等[1]在对1 份猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）实时定量逆转录PCR（RT-qPCR）阳性样品进行宏基因组测序中，拼接出1 个长度为11 276 bp 的基因组序列；该基因组序列可编码1 个预测长度为3 635 个氨基酸的多聚蛋白（polyprotein）；该基因组序列同完成部分鉴定的蝙蝠瘟病毒（Rhinolophus affinis pestvirus，RaPV）基因序列的一致性为68%，同已知的瘟病毒属其他病毒基因序列的一致性为25%～28%；研究认为这是一种新的病毒，应归于瘟病毒属，暂时将其命名为猪非典型瘟病毒（atypical porcine pestivirus，APPV）。随后，Arruda 等[2]在患有先天性震颤（congenital tremor，CT）的病猪中发现APPV，且将感染APPV 猪的带毒血清接种怀孕母猪后，在所产的仔猪中复制出CT 临床症状。相似的结果也在其他研究[3-5]中得到验证，如在荷兰10 个猪场采集的具有CT 症状的99 份疑似样品中，APPV 检出率达到100%，而在采自无临床症状的猪样品中，APPV 检出率只有9%（6/66），说明APPV 与CT 密切相关。

仔猪CT 也被称为“猪先天性痉挛症”或“仔猪先天性肌阵挛病”（myoclonia congenita）[6]、“仔猪震颤病”（shaking piglets/ trembles）、“跳跳病”（jumpy pig disease）、“舞蹈病”（dancing pig disease）[7]等，在国内形象地将其称为“仔猪抖抖病”。它最早于1922 年在美国以“舞蹈病”相称[7]。随后在法国（1934 年）[8]、澳大利亚（1937年）[9]、加拿大（1957 年）[10]相继有此病的报道。我国最早可能于1962 年报道此病，称其为“仔猪先天性肌阵挛病”[6]。现在欧洲以及北美洲、南美洲等地区皆有病例报道，说明该病已呈全球流行趋势[2]。

国内有人将APPV 命名为非典型猪瘟病毒。鉴于国内存在非典型性猪瘟的持续流行，为避免误解，本文将该病毒翻译为猪非典型瘟病毒，以示区别。自2015 年APPV 在美国首次被发现以来，国外相关的文献报道越来越多。国内也有相关研究跟进，但还没有关于APPV 研究进展的报道。因此，本文就APPV 的病原学、流行病学、检测技术研究以及疫苗研发等进行全面介绍，以期为我国APPV防控及研究提供参考。

1 病原学

APPV 属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus），为单股正链RNA 病毒。根据最新的进化趋势，国际病毒分类委员会于2017 年发布的分类指南中，将瘟病毒属划分为11 个分支（A—K），而APPV 为瘟病毒属K（PestivirusK）的代表毒株[11]。

APPV 基因组全长11～12 kb（11 475 bp[12]、11 526 bp[13]），包括5'-UTR 和3'-UTR 非编码区及1 个多聚蛋白阅读框。该阅读框主要编码1 个长的多聚蛋白前体（大小约3 635 个氨基酸）。该多聚蛋白可被蛋白酶水解成多个结构蛋白和非结构蛋白。与其他瘟病毒属病毒一样，该多聚蛋白包含所有的结构蛋白（C、Erns、E1、E2）及非结构蛋白（Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B），其编码顺序为Npro-C-Erns-E1-E2-P7-NS2-3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B[1]。目前还未涉及APPV 的功能基因组学研究，但利用E2 和Npro蛋白编码全基因的序列比对，可将APPV 分为4 个基因型（A—D）[12]。有研究[14]还发现，与同为瘟病毒属的古典猪瘟病毒（CSFV）相比，APPV 不同毒株之间的遗传变异性较大（最大遗传距离差异可达21%），且有1 株中国分离株在非结构蛋白NS5A 区域内发生了93 个核苷酸的缺失。

2 流行病学

2.1 宿主

家猪和野猪均可携带APPV。瘟病毒属病毒可以在种间传播，因此不排除猪以外其他动物有感染APPV 的可能性，但在自然传播中仅限于偶蹄动物之间。根据目前研究显示，未从羊样品中检出该病毒[15]。

2.2 病毒侵袭性

利用RT-qPCR 方法可从感染仔猪的多种组织样品中检出APPV，检出率从高到低依次为全血95%、肠系膜淋巴结90%、支气管淋巴结90%、胸腺90%、脾脏90%、脑干90%、小脑88%、肾脏85%、心脏85%、脊髓80%、大脑73%、血清63%、粪便34%和鼻拭子29%。血清、鼻拭子、脑脊髓液、肠系膜淋巴结、支气管淋巴结、脾脏和脐带血中的病毒含量较高，粪便、小脑、脊髓、肾脏、胸腺和心脏中的病毒含量次之，大脑、脑干和全血中的病毒含量最低[2]。另据报道[4]，各部位中的APPV 含量由高到低依次为腭舌弓腺、颌下淋巴结、胃、鼻腺、小脑、三叉神经、肱二头肌、肱神经丛、结肠、小肠、坐骨神经、胸腺、支气管肺淋巴结、肾脏、脊髓腰神经、肾脏、肺脏、最长肌、胸部脊髓和脑干。

我国科研人员也进行了APPV 侵袭性研究。Yuan 等[16]研究发现，APPV 对神经系统及外周免疫器官具有偏嗜性；Shen 等[17]发现，各脏器中的病毒含量以小脑和心脏最高，其他依次为脊髓、肺脏、脾脏、肾脏、颌下淋巴结、腹股沟淋巴结、肺门淋巴结、大脑和肝脏。

Schwarz 等[5]研究发现，APPV 核酸可在仔猪血清和唾液中持续存在12 周以上。Ed Groof[3]研究发现，APPV 阳性仔猪到第5 个月时，病毒血症滴度才开始下降。以上结果均很好地解释了为何APPV 感染农场会持续出现新的病例。

2.3 传播途径

对APPV 的自然传播途径目前还不清楚。但有研究[4]发现，APPV 在唾液腺、十二指肠、胰腺和结肠中的滴度较高，因此推测APPV 也可能通过粪-口途径传播；攻毒试验结果显示，APPV 可经母猪垂直传播给仔猪，导致仔猪发病，且与CSFV和牛病毒性腹泻病毒（BVDV）相比，可能更容易垂直传播。

Gatto 等[18]对美国4 个种猪场进行APPV 检测，发现APPV 在包皮拭子、包皮液和精液中的检出率分别是23.81%（5/21）、22.81%（26/114）和12.91%（59/457）。但APPV 是否能通过精液传播还需进一步研究。

另有报道[19]猜测，气溶胶可能对APPV 传播发挥一定作用。

2.4 有关国家流行病学调查

在美国首次报道APPV 后，西班牙[3]、奥地利[5]、意大利[20]、德国[16，21]、瑞典[21]、英国[22]、荷兰[3]等欧洲国家，加拿大[23]、巴西[24]等美洲国家，以及中国[13-14，17-18，25]、韩国[26]等亚洲国家均报道发现该病毒。在对欧洲和亚洲的1 460 份血清样品的普查中，发现APPV核酸阳性率为8.9%（130份），血清阳性率约为60%[14]。德国的调查[4，27]显示，APPV 在健康猪群中的个体流行率约为2.4%，场间流行率约为10%，野猪感染率达19%。

APPV 被发现后，国内科研人员很快进行了相关调查。Zhang 等[26]在广东省2 个猪场中发现有APPV 流行（发病率分别为5.8%和6.3%），并对测序毒株（GD1 株和GD2 株）进行了比对分析。Zhang 等[12]和Wu 等[13]分别对APPV 广西株（CH-GX 2016）和江西株（JX-JM01-2018A01）进行了全基因组测序分析。Shen 等[17]在2016 年监测发现，广东省一猪场（存栏3 000 头，发病率为2.67%，死亡率为60%）和贵州省一猪场（存栏800 头，发病率约为50%）均发生“仔猪抖抖病”，经RT-PCR 检测，均检出APPV 核酸阳性，并将测序毒株命名为APPV-China/GZ01/2016（GZ01）和APPV-China/GD-SD/2016（GD-SD）。Yuan 等[16]对我国南方地区（主要是广东省）进行监测发现，APPV 的场内流行率为0～20%，个体平均流行率约为5.2%。

其他国家的研究人员对其保存的历史样品进行了追溯性研究，如2016 年荷兰的De Groof 等[3]（2012 年样品）、2016 年德国的Postel 等[4]（2007年样品）和2017 年西班牙的Muñoz-González等[28]（1997 年样品）均从实验室历史保存样品中检测到APPV 阳性。Yuan 等[16]对已公布的APPV序列进行起源和遗传进化分析，结果发现APPV 中国分离株极有可能起源于德国。综上说明，APPV早已在全球广泛流行。

3 检测与诊断技术

CT 至今已出现100 年，可由多种病原导致，除APPV 外还包括CSFV、猪圆环病毒2型（porcine circovirus 2，PCV2）、猪捷申病毒（porcine teschovirus，PTV）、猪肠道病毒（porcineenteroviruses，PEV）、猪萨佩罗病毒（porcine sapelovirus，PSV）。临床中的混合感染现象也较严重，如Ed Groof 等[3]发现攻毒试验中所使用的APPV 阳性血清污染有星状病毒（astrovirus），Possatti 等[29]发现PTV 和APPV 混合感染后可能导致仔猪死亡率增高等。因此，APPV 的实验室检测至关重要。

3.1 病原分离与鉴定

Hause 等[1]初次分离APPV 时，曾用MARC-145、Vero、Vero 76、HCT-8、BT、MDBK、ST、PK-15 和MDCK 细胞系进行分离，但在培养过程中均未观察到细胞病变，且传代2 次后RT-qPCR检测全部为阴性，病毒分离失败。Ed Groof 等[3]使用PK-15、SK6 和原代猪肾细胞（primary swine kidney cells），Postel 等[4]使用瘟病毒属敏感细胞系（PK-15、SK6和STE）、猪淋巴细胞38A1D（porcine lymphoma cells）和猪上皮细胞PEDSV.15（porcine endothelial cells），Yuan 等[16]使用PK-15、SK6、IBRS 和猪睾丸细胞（swine testis cellline，ST）进行病毒分离，结果均以失败告终。Arruda 等[2]也曾尝试分离病毒进行攻毒试验，结果也未成功。而Schwarz 等[5]使用了未吃母乳的APPV 阳性仔猪血清，可以在SK6 细胞和PK-15 细胞中将APPV 传代到第5 代，只是病毒滴度很低，提示初乳中的抗体可能在病毒分离过程中发挥了一定的阻碍作用。目前只有德国科学家Beer 等[15]利用猪肾细胞（SPEV）成功分离到APPV，Postel 等[20]利用该细胞系将APPV 传代至少11 代。由此可见，APPV在细胞系中的繁殖感染水平较低，这可能与其E2蛋白的特殊结构有关[3]。

3.2 分子生物学鉴定

RT-qPCR 和逆转录PCR（RT-PCR）是检测APPV 的主要方法。目前建立的RT-qPCR/RT-PCR方法主要对NS3[2]、NS5A[17]、NS5B[5]、5'非翻译区（5'non-translated region，NTR）[3]等区域进行扩增。但因为可参考的APPV 基因序列较少，很多引物仍需要进行深入论证，如Postel 等[20]发现，针对瘟病毒属的NTR 引物（PanPesti140f 和PanPesti241r）可以与APPV和CSFV发生交叉反应。

其他方法也可用于APPV 检测，如针对NS3和NS4B 的SYBR Green 方法[4]和套式PCR（RTnested PCR）方法。Possatti 等[29]使用针对NS5B基因的套式PCR 和针对NS2/3 区域的半套式PCR（semi-nested PCR）进行检测，结果发现针对NS2/3 区域的扩增效果好于NS5B基因，其原因可能是因为设计NS2/3 区域引物时可供参考的APPV序列更多。

3.3 血清学鉴定

目前尚无商品化的血清学诊断试剂盒面世，但相关研究已迅速启动。Hause 等[1]和Postel 等[20]分别建立了针对APPV Erns蛋白的间接ELISA方法，其中Postel 等将其建立的ELISA 方法与商品化的CSFV 试剂盒（针对E2 蛋白，IDEXX 和Idvet 厂家）和瘟病毒属特异ELISA 试剂盒（针对NS3 蛋白，IDEXX 厂家）进行了比较，证实目前所用的CSFV 试剂盒和瘟病毒属特异ELISA 试剂盒不能与APPV 阳性血清发生交叉反应。另外Schwarz等[5]建立了针对APPV NS3 蛋白的阻断ELISA 方法，并将其用于血清学临床监测。

4 疫苗研发和治疗

4.1 疫苗研发

目前尚无APPV 疫苗研发的报道，但据了解，国内一些研究机构和大型动物疫苗生产企业已经着手此疫苗的研发（包括弱毒苗和E2 亚单位疫苗，目前尚无产品申报注册）。动物攻毒效力检验是评价动物疫苗好坏的主要标准，但是到目前为止，APPV 的病毒分离和猪攻毒模型试验仍很难建立。其原因：弱毒疫苗致弱过程需要能够繁殖APPV 的细胞系，且病毒滴度相对较高才能应用于生产；而攻毒模型建立存在的主要问题是APPV 是否需要与其他病毒（CSFV、伪狂犬病毒等）协同作用才能引起震颤等症状尚未确定。这些给疫苗研发和生产带来很大阻力。

4.2 治疗

目前针对APPV 感染无特效药物治疗。导致仔猪死亡的主要原因是病毒感染导致的震颤使仔猪不能及时吃上初乳或母乳饥饿而死，因此可采取代养或人工哺乳方式，提高仔猪的自然恢复能力，而护理程度直接关系到感染猪群的死亡率。

5 结语

综上所述，APPV 作为新发现的病原，基础研究相对较少，目前仅证实其与CT 紧密相关。虽然对怀孕母猪接种带毒血清可以导致仔猪发病，但是因为APPV 不容易被分离，缺少最重要的病毒攻毒试验结果，其致病机理仍需要进一步研究证实。而疫苗研究也需要在前期基础研究深入的基础上才有可能获得成功。同时，APPV 和其他多种病原均可引起CT，且临床中混合感染现象严重，因此其感染需要全面考虑临床症状，才能给予正确的判断和处置。深入了解APPV 的病原学、流行病学，特别是其引发的感染免疫学、致病机理和发病进程，对于APPV 感染的有效诊断、预防和治疗具有重要意义。