具有光协同抗菌作用纳米银复合材料的制备

2022-12-15 11:33刘天宇钱泽丹沈颖欣庞千粤卢晴风意1
合成树脂及塑料 2022年6期
关键词:光照复合材料抗菌

刘天宇,徐 丽,钱泽丹,沈颖欣,庞千粤,卢晴风,刘 意1,*

(1.广东药科大学 药学院,广东 广州 510006;2.广东药科大学 医药化工学院,广东 中山 528458)

细菌在环境中普遍存在,目前最有效的治疗细菌感染的方法是使用抗生素;然而抗生素的使用不可避免地导致耐药菌株出现,如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐万古霉素金黄色葡萄球菌[1]。在过去的几十年里,抗生素耐药基因的出现[2],导致危及生命的感染增加,已经成为严重的公共卫生负担,因此,迫切需要找到一种抗生素替代品[3]。

目前,已经报道了多种能替代抗生素的材料[如金属离子、银纳米颗粒(AgNPs)[4]、金属氧化物纳米颗粒[5]、石墨烯、纳米碳和季铵化合物[6]],这些新材料可以降低或抑制细菌的活力。作为广谱抗菌剂[7]的AgNPs已获得美国食品药品管理局批准并广泛应用于抗菌敷料领域[8]。虽然AgNPs可以达到令人满意的抗菌效果,但一些含银敷料或软膏由于银离子的突量释放具有极高的生物毒性[9],因此,控制银离子的释放量成了含AgNPs抗菌剂需要克服的主要问题[10]。另外,因AgNPs常规情况下呈现易于聚集的趋势,导致抗菌性能降低[11]。为解决这些问题,有必要为AgNPs找到合适的表面钝化或支持材料,在保持其抗菌活性的同时具有更好的生物相容性[12]。

光协同抗菌材料也是当前研究的一大热点,使用对可见光响应的光敏剂,可以从周围的分子氧中产生活性氧(ROS),起到抗菌的作用[13]。经典的光敏剂包括四吡咯、酞菁、吩噻嗪、亚甲基蓝等,但它们存在低水溶性、较差分散性、复杂的合成路线和低生物相容性等缺点,限制了在临床上的应用。

碳量子点(CQDs)在可见光区域内有响应,具有用作光敏剂的潜力,同时,基于CQDs的纳米复合材料在抗菌方面也具有优势。CQDs是一种新型的无金属荧光纳米粒子,具有合成简单、毒性低、生物相容性好、易于表面修饰[14]等优点,已广泛应用于成像、传感、催化等领域[15-18]。CQDs也被作为抗菌剂研究。一方面由于CQDs表面所带电荷不同,对不同种类细菌表现出不同的抗菌效果,带正电的CQDs诱导内源性ROS的能力明显高于带负电的CQDs。掺杂其他元素的CQDs对细菌具有生长抑制作用,可能是由于高正电荷破坏了细菌膜[19];另一方面,CQDs的杀菌活性还取决于它们的表面化学基团和尺寸。本工作利用CQDs的特性,采用原位法制备AgNPs@硫氮掺杂碳量子点(S,N-CQDs)复合材料,试图实现AgNPs与S,N-CQDs良好的光协同抗菌作用,并解决传统银离子抗菌剂的生物毒性,提高生物相容性,扩大纳米银基复合材料的应用范围。

1 实验部分

1.1 主要试剂

柠檬酸(CA),β-巯基乙胺,硝酸银:均为分析纯,上海麦克林生化科技有限公司。营养琼脂,溶菌肉汤培养基(LB),沙氏葡萄糖液体培养基,马铃薯葡萄糖琼脂:广东环凯微生物科技公司。金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,MRSA,白色念珠菌:广东文睿生物有限公司。

1.2 试样制备

1.2.1 S,N-CQDs的制备

将0.600 g CA和0.195 g β-巯基乙胺溶于10 mL纯水中,然后转移到50 mL聚四氟乙烯中,将其置于不锈钢反应器加热至150 ℃,反应3 h。反应结束后冷却至室温,形成棕黄色溶液,在透析袋(截留相对分子质量1 000)中透析24 h,每4 h换一次水,将透析液冷冻干燥得到固体,即S,N-CQDs。

1.2.2 AgNPs@S,N-CQDs的制备

称取定量S,N-CQDs溶于去离子水中,质量浓度为1 mg/mL,共100 mL;称取质量浓度为20 mg/mL的硝酸银溶液,在磁力搅拌条件下,向S,NCQDs溶液中加入5 mL硝酸银溶液。连续搅拌48 h后,得到淡黄色溶液。透析48 h除去未反应的银离子,在此期间每6 h换一次水。所得溶液经过滤、冷冻、干燥,得到淡黄色AgNPs@S,N-CQDs颗粒。

1.3 测试与表征

纳米颗粒的结构采用日本岛津制作所的UV-2600型紫外-可见分光光度计检测,200~800 nm紫外吸收光谱。傅里叶变换红外光谱(FTIR)采用日本岛津制作所的IR Affinity-1型傅里叶变换红外光谱仪测试,波数为500~4 000 cm-1。纳米颗粒形貌和粒径采用日本株式会社日立制作所的H-7650型高分辨透射电子显微镜观察。

1.4 抗菌性能测试

1.4.1 最小抑菌浓度(MIC)检测

实验前,固体培养基上的细菌,包括金黄色葡萄球菌、MRSA和大肠杆菌,在液体LB中培养24 h,白色念珠菌在沙氏葡萄糖液体培养基中培养24 h。在无菌96孔板中,每孔加入100 μL LB,在第一孔加入100 μL一定浓度的S,N-CQDs或AgNPs@S,N-CQDs复合材料,混合均匀后吸取100 μL至第二孔中,重复此步骤至最后一孔,弃去第十二号孔吸取的100 μL,各孔加入100 μL浓度为2×105CFU/mL的菌悬液。MIC通过浊度法测量,对应无浑浊孔的CQDs或AgNPs@S,N-CQDs复合材料的浓度即为MIC值。所有实验平行测三次。

1.4.2 光协同抑菌率检测

将S,N-CQDs和AgNPs@S,N-CQDs复合材料与不同种类细菌在不同浓度下共培养后,采用420 nm光源改变光照功率和光照时间,进行抑菌率测试实验。以MRSA为例进行实验:进行抑菌率平板实验前,将固体培养基上的MRSA在LB中培养24 h;然后将AgNPs@S,N-CQDs复合材料或S,NCQDs与细菌混合,使最终系统中的细菌浓度保持在1×105CFU/mL,AgNPs@S,N-CQDs复合材料或S,N-CQDs的质量浓度为0.050 mg/mL,平板涂布,利用420 nm光源采用6 W或15 W光照0,1,2,3,4 min,在37 ℃恒温孵育箱中培养24 h,统计各平板的菌落数,按式(1)计算抑菌率。然后固定15 W光照功率和3 min光照时间,改变AgNPs@S,N-CQDs或S,N-CQDs浓度,使最终系统中的细菌浓度保持在1×105CFU/mL,试样质量浓度为0.010,0.025,0.050,0.100,0.200,0.400,0.800 mg/mL,在37 ℃恒温孵育箱中培养24 h,试样组为AgNPs@S,NCQDs复合材料或S,N-CQDs,对照组为与试样组等量的LB,统计各平板菌落数,并计算抑菌率。

1.5 溶血实验

将定量2%(w)血细胞以5 000 r/min的速率离心5 min,弃去上清液,收集血细胞,加入定量灭菌磷酸缓冲盐溶液(PBS),重悬后同样条件离心,重复三次,将血细胞分散在含有AgNPs@S,N-CQDs或S,N-CQDs的PBS缓冲溶液中,最终体系中血细胞质量分数为1%,AgNPs@S,N-CQDs或S,N-CQDs浓度为0.010,0.025,0.050,0.100,0.200,0.400,0.800 mg/mL,阴性对照组为同体积PBS缓冲溶液,阳性对照组为同体积的高浓度AgNPs@S,N-CQDs水溶液,在37 ℃恒温水浴锅孵育2 h。最后,将血细胞在5 000 r/min离心5 min,测定上层清液在波长540 nm处的吸光度,按式(2)计算溶血率。

式中:OD540(试样)为试样在540 nm处的吸光度;OD540(阴性对照)为阴性对照组在540 nm处的吸光度;OD540(阳性对照)为阳性对照组在540 nm处的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 AgNPs@S,N-CQDs复合材料的表征

从图1可以看出:S,N-CQDs在230~250 nm及350 nm处有紫外特征吸收肩峰,归因于C=O的n-π*跃迁,AgNPs@S,N-CQDs在400 nm处存在紫外吸收峰,当AgNPs存在时会在400 nm左右产生紫外特征吸收峰,说明AgNPs@S,N-CQDs已成功合成。从图1还可以看出:3 000~3 500 cm-1的宽吸收带是由于O—H和N—H的拉伸振动,表明S,NCQDs表面有许多氨基和羟基,说明S,N-CQDs和AgNPs@S,N-CQDs具有良好的亲水性;而2 600 cm-1处的吸收峰归因于巯基,1 726 cm-1处的吸收峰归因于C=O的拉伸振动,说明AgNPs与S,NCQDs中含氧官能团(即—COOH)存在相互作用,是通过形成化学键或静电吸引来实现的,1 380 cm-1处的吸收峰归因于S=O的拉伸振动,AgNPs@S,N-CQDs在此处的峰变尖锐,说明S=O的断裂,结合1 654 cm-1处出现的峰,说明AgNPs负载在S,N-CQDs上。

图1 S,N-CQDs和AgNPs@S,N-CQDs的紫外吸收光谱和FTIRFig.1 UV absorption spectra and FTIR spectra of S,N-CQDs and AgNPs@S,N-CQDs

2.2 高分辨透射电子显微镜(HRTEM)观察

从图2可以看出:AgNPs被包裹在S,N-CQDs之间,分散性良好,颗粒呈类球形,粒径均一,平均粒径为5 nm;0.238 nm晶格间距是Ag的(111)特征晶格间距,表明成功合成了AgNPs@S,NCQDs复合材料。

图2 AgNPs@S,N-CQDs复合材料的HRTEM照片Fig.2 HRTEM image of AgNPs@S,N-CQDs

2.3 抗菌性能

从表1可以看出:S,N-CQDs同样具有广谱抗菌性能,对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)、阴性菌(大肠杆菌)、耐药菌(MRSA)、真菌(白色念珠菌)的代表性菌种都能起到抗菌作用;与S,NCQDs相比,由于引入AgNPs@S,N-CQDs的MIC值较低,说明AgNPs@S,N-CQDs的抗菌性能明显强于S,N-CQDs,表明AgNPs@S,N-CQDs在抗菌性能方面优势明显。

表1 AgNPs@S,N-CQDs及S,N-CQDs针对不同种细菌的MIC值Tab.1 MIC values of AgNPs@S,N-CQDs and S,N-CQDs against different kinds of bacteria mg/mL

2.4 光协同抑菌

从图3可以看出:光照条件下,对照组抑菌率随着光照时间或光照功率的增加而增大,单独光照情况下同样可以产生一定程度的抑菌作用。与对照组相比,由于S,N-CQDs本身具有抗菌性能,故在光照时其抑菌率较高;AgNPs@S,N-CQDs在光照时表现出较对照组和S,N-CQDs更好的抗菌性能,随着光照时间和光照功率的增加,抗菌效果也越来越明显。

图3 不同光照功率和时间下S,N-CQDs与AgNPs@S,N-CQDs对MRSA的抑菌率Fig.3 Inhibition rate of AgNPs@S,N-CQDs against MRSA under different light time and different light intensity

从图4可以看出:在15 W光照功率和3 min光照时间条件下,通过计算抑菌率已接近80%,表现出优异的光协同抗菌作用。在固定光照时间和光照功率条件下,改变AgNPs@S,N-CQDs或S,NCQDs浓度,抑菌率也随之改变。从图5可以看出:在0.050 mg/mL AgNPs@S,N-CQDs存在条件下,光照功率和光照时间固定时,抑菌率已接近80%,菌落数明显减少,能有效抑制MRSA的生长,说明在该光源激发情况下,AgNPs@S,N-CQDs有较强的光协同抗菌作用。

图4 不同浓度AgNPs@S,N-CQDs条件下采用15 W光照3 min平板实验图片Fig.4 Plate pictures about different concentrations of AgNPs@S,N-CQDs with 15 W light for 3 min

图5 不同浓度AgNPs@S,N-CQDs条件下采用15 W光照3 min的抑菌率Fig.5 Inhibition rate of different concentrations of AgNPs@S,N-CQDs with 15 W light for 3 min

2.5 溶血实验

将血细胞与不同浓度的AgNPs@S,N-CQDs或S,N-CQDs培养2 h后,从图6和图7可以看出:阳性对照组呈现明显的溶血现象。当AgNPs@S,NCQDs质量浓度低于0.200 mg/mL时,溶血率低于5%,即便当AgNPs@S,N-CQDs质量浓度为0.400 mg/mL时,也无诱导溶血现象,因此AgNPs@S,NCQDs的生物相容性良好。

图6 不同浓度AgNPs@S,N-CQDs的溶血图像Fig.6 Hemolysis images of AgNPs@S,N-CQDs on red blood cell with different concentrations

图7 不同浓度AgNPs@S,N-CQDs的溶血率Fig.7 Hemolysis ratio of AgNPs@S,N-CQDs on red blood cell with different concentrations

3 结论

a)采用原位法制备了AgNPs@S,N-CQDs复合材料,复合材料中AgNPs呈类球形,分散均匀,平均粒径5 nm。

b)AgNPs@S,N-CQDs复合材料具有良好的抗菌性能及广谱抗菌特性,在光照刺激下具有光协同抗菌作用。当复合材料质量浓度为0.050 mg/mL,波长为420 nm,光照功率为15 W,光照时间为3 min时,对MRSA的抑菌率可达80%,能有效抑制MRSA的生长。

c)当AgNPs@S,N-CQDs复合材料质量浓度为0.400 mg/mL时,也几乎不会诱导溶血,说明其具有良好的生物相容性。

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