血必净注射液对体外循环后急性肺损伤大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡相关微RNA 表达的影响

徐朝军 张胜康 张 怡 周代勇 宋 岚

1.湖南中医药大学第一附属医院心胸外科，湖南长沙 410007；2.湖南中医药大学生物化学与分子生物学教研室，湖南长沙 410208

随着体外循环方法和外科技术的提高，体外循环心脏手术的安全性大大提高，然而肺部并发症是心脏术后重要的死亡原因，而大多数肺部并发症与体外循环术后急性肺损伤有关[1-2]，微RNA（miRNA）是一类内源性的非编码RNA 分子，它们在转录后水平沉默特定基因，对生物体基因表达发挥精细调节的作用。研究发现microRNA 可能在体外循环急性肺损伤中也发挥重要作用[3-4]。

血必净注射液临床广泛用于脓毒症及急性肺损伤[5-6]。本课题组前期研究发现，血必净可以有效改善体外循环术后患者的肺功能，但是其具体机制目前尚未明确[7-9]。近年来研究表明，中药及其活性成分对miRNA 能起到广泛调节作用[10-11]，本研究运用生物信息学技术获取与肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡相关性的候选miRNAs，再建立SD 大鼠体外循环肺损伤模型，通过real-time PCR 的方法观察血必净对体外循环急性肺损伤肺泡Ⅱ型上皮细胞中候选miRNA 表达的影响，从分子水平探讨血必净注射液治疗体外循环急性肺损的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 30 只清洁级雄性SD 大鼠购于湖南中医药大学动物中心，动物使用许可证号：SYXK（湘）2013-0005（动物合格证号：43004700020981），20～22 周龄，体重450～500 g。所有动物实验均获得湖南中医药大学实验动物伦理委员会许可并按照国际实验动物护理和使用指南进行（ZYFY20171017）。

1.1.2 实验药品 血必净注射液（天津红日药业股份有限公司，批号：Z20040033）；戊巴比妥钠（sigma 公司）。

1.1.3 实验试剂 DMEM 培养基、Trizol、cDNA 第一链合成试剂盒（货号：11752250，Invitrogen 公司）；无支原体小牛血清（杭州四季青生物工程公司）；10%水合氯（青岛育龙化学试剂有限公司）；弹性蛋白酶（Becton-Dickinson 公司）；胰脱氧核糖核酸酶（Sigma 公司）；鼠IgG（Becton-Dickinson 公司）；TaqManTMmicroRNA 分析试剂盒（货号：4366596，Biosystems 公司）；PCR 引物由上海英骏公司合成；miRcute miRNA 提取分离试剂盒（货号：CW0627，北京康为世纪生物科技有限公司）；miRNA 荧光定量检测试剂盒（货号：CW2142，北京康为世纪生物科技有限公司）。

1.1.4 实验仪器 荧光定量PCR 仪（LC-480Ⅱ型，美国Perkin-Elmer 公司）；CO2细胞培养箱（贺利氏HERAcell 150 i，赛默飞世尔公司）；超净工作台（CJ-1B 北京半导体设备厂）；倒置相差显微镜（CKX31，日本Olympus 公司）；-80℃低温冰箱（Forma 995，美国FORMA 公司）；可见紫外分光光度计（UV-2600i，日本岛津公司）。

1.1.5 相关数据库的使用及靶基因预测工具 大鼠miRNA 数据库：miRBase（http：//www.mirbase.org/cgi-bin/querv.pl?terms=rat）；mRNAMap（http：//mimamap.mbc.nctu.edu.tw/html/search.html）；miRDB（http：// www.mirdb.org/cgi-bin/search.egi）。

miRNA 靶基因预测软件：MirTarget（http：//llmirdb.org/miRDB/policy.htral）；TargetScan（http：//www.targetscan.org/vert 50/）；Blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）；DAVID（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/）。

1.2 研究方法

1.2.1 筛选大鼠miRNAs 利用miRBase 数据库、mRNAMap 数据库及miRDB 数据库，以“rat”为关键词搜索，获得的各数据库的大鼠miRNAs，然后整合去掉重复miRNAs 信息。

通过MirTarget 和TargetScan 软件，筛选出与大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡相关的靶基因及其对应的miRNA。

获得候选miRNAs，采用DAVID 软件，分析上述靶基因预测工具获得的miRNAs 靶基因的功能，以“肺泡Ⅱ型上皮细胞”“凋亡”“肺脏”为关键词筛选，从其中找出与大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡相关的靶基因（score＞95），并得到对应的miRNAs。

1.2.2 动物分组及体外循环所致急性肺损伤大鼠模型制备 按随机数字表法将30 只大鼠分为三组：假手术组、体外循环组、血必净组，每组10 只。假手术组于血管穿刺前2 h、体外循环组于体外循环前2 h 经腹腔注射4 ml/kg 的生理盐水。血必净组在麻醉后体外循环前2 h 经腹腔注射血必净注射液4 ml/kg。实验前大鼠自由饮水但禁食6 h。采用腹腔内注射麻醉（2%戊巴比妥按50 mg/kg），根据术中情况予静脉追加戊巴比妥以维持麻醉。采用颈部气管切开后行气管内插管并缝合固定，予以小动物呼吸机行机械通气。在将温度探头置入大鼠直肠内监测温度并采用变温毯调节体温，经股动脉置管监测有创血压，肢体导联连接心电监护仪进行监测。假手术组不建立体外循环，体外循环组和血必净组参照文献[10]方法建立大鼠体外循环模型并进行体外循环管理，用20G 套管穿刺尾动脉并与小动物膜肺的动脉血出口连接，采用多孔16G 套管针穿刺右侧颈外静脉并置管于右心房处，引流静脉血入储血槽，采用动物特制膜肺进行氧合，由转流泵驱动体外循环。转流开始时灌注量约40 ml/（kg·min），循环流量逐步增加至100 ml/（kg·min），保持该流量并维持此转速1 h 后逐步降低流量直到停止体外循环，术中密切监测心率、血压、体温等指标，体外循环结束后先拔除静脉插管，以低流量灌注将机器管路里的血液经尾动脉回输动物体内，在血压稳定后拔除插管，继续监测有创血压2 h，严密观测大鼠生命体征，麻醉苏醒，放入鼠笼，继续禁食不禁饮。假手术组仅行动、静脉穿刺置管不行体外循环，其他处理同体外循环组。

1.2.3 大鼠肺湿/干重比（wet to dry weight ratio，W/D）和大鼠肺泡损伤数定量评价指标（index of quantitative assessment，IQA）的测定 体外循环结束后4 h 放血处死大鼠，取左肺下叶，生理盐水反复清洗，滤纸去除多余水分并立即称重，即为湿重（wet，W）；然后将这些样品真空干燥直到重量恒定再予以称重，即为干重（dry，D），计算W/D。取左上肺组织，经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，采用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining，HE）染色。测定肺泡IQA。

1.2.4 SD 大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞分离及培养SD 大鼠制备体外循环肺损伤模型后进行肺泡Ⅱ型上皮细胞分离。SD 大鼠进行腹腔注射麻醉，胸主动脉放血法处死大鼠。经肺动脉和支气管反复灌注PBS（8 次，10 ml/次），以减少肺组织中的中性粒细胞。剪取适量肺组织置于37℃水中水浴20 min，再经支气管导管向气管内缓慢注入含172 U 弹性蛋白酶的40 ml PBS。仔细修剪与肺组织相连的其他组织和心脏组织，将1 000 U DNAse I 加入肺组织中，再用显微剪将肺组织反复剪碎，加入5 ml 低IgG 的胎牛血清灭活DNAseI。在室温条件下轻柔地搅拌20 min，先后采用孔径为500、200、105 μm 的聚酯筛网过滤，然后重悬于30 ml DMEM中，予以450 g 离心10 min，紧接着再将细胞重悬于45 ml DMEM 中。然后将收集细胞接种至事先包被鼠IgG（30 μg/ml）的100 mm 培养皿中37℃培养1 h，以去除剩余的中性粒细胞。采用DMEM多次洗涤培养皿并收集肺泡Ⅱ型上皮细胞。再次离心后将肺泡Ⅱ型上皮细胞重悬于10～20 ml DMEM（含10%小牛血清，1%庆大霉素，1%青霉素，1%非必需氨基酸，1%L-谷氨酸）中。先行细胞计数，并测定细胞活力（台盼蓝染色）。选取检测活性＞95%的细胞接种至8 孔培养板中（1×106/ml，0.5 ml/孔）。置于5%CO2培养箱中37℃条件下培养48 h，收集贴壁细胞并得到肺泡Ⅱ型上皮细胞，再将细胞继续培养于含10%小牛血清，2%庆大霉素，2%青霉素，2%非必需氨基酸，2%L-谷氨酸的DMEM 中，用于后续实验。

1.2.5 RFPCR 检测microRNA 表达 用miRNA 提取试剂盒提取细胞样本中miRNA。使用TaqMan microRNA reverse transcription 试剂盒逆转录micorRNA生成cDNA，逆转录体系和条件参考说明书[反应体系：Poly（A）反应液4 μl，dNTP（10 mmol/L）1 μl，25 μmol/L RT 引物3 μl，5×RT 缓冲液4 μl，逆转录酶0.5 μl，无RNA 酶水7.5 μl]。qRT-PCR 反应体系参照试剂盒说明书进行[反应体系：2×miRNA qRT-PCR 预混液10 μl，上游引物（10 μmol/L）0.4 μl，下游引物（10 μmol/L）0.4 μl，模板2 μl，加入灭菌蒸馏水至20 μl]。rno-miR-17-5p 正向引物序列5’-TGTCGTGGAGTCGCC-3’，反向引物序列5’-CAAAGUGCUUACAGUGC-3’；rno-miR-34a-5p 正向引物序列5’-TGTCGTGGAGTCGCC-3’，反向引物序列5’-UGGC AGUGUCUUAGCU-3’；rno-miR-26a-5p 正向引物序列5’-TGTCGTGGAGTCGCC-3’，反向引物序列5’-UUCAAGUAAUCCAGGA-3’；rno-miR-21-5p 正向引物序列5’-TGTCGTGGAGTCGCC-3’，反向引物序列5’-UAGCUUAUCAGACUGA-3’；rno-miR-375-3p 正向引物序列5’-TGTCGTGGAGTCGCC-3’，反向引物序列5’-UUUGUUCGUUCGGCUC-3’；采用U6 RNA 作为内参，正向引物序列5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物序列5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。采用2-△△ct法计算miRNA 的表达变化。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0 对所得数据进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，比较采用t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠miRNA 列表信息

通过数据库搜索、整合得到495 个大鼠miRNA。利用MirTarget 等靶基因在线预测软件预测到大鼠438 个miRNA 的靶标基因1 932 个（Score＞99.0）。未预测到的其他57 个miRNAs，一部分miRNA 没有搜索到靶基因，还有一部分miRNA 与438 条miRNA 中部分miRNA 具有高度相似结构。对miRNA 分子进行功能注释及分析，获取与肺泡Ⅱ型上皮细胞、细胞凋亡以及在肺脏表达相关的miRNA。然后通过DAVID工具对miRNA 靶基因分析，并将功能分析结合文献调研等方法，确定rno-miR-17-5p、rno-miR-34a-5p、rno-miR-26a-5p、rno-miR-21a-5p 和rno-miR-375-3p 这五条miRNA 与肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡相关。

2.2 三组大鼠肺组织W/D、IQAI 比较

体外循环组W/D 和IQA 高于假手术组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。血必净组W/D、IQA 低于体外循环组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

表1 三组大鼠肺组织W/D、IQA 比较（）

表1 三组大鼠肺组织W/D、IQA 比较（）

注 与假手术组比较，aP ＜0.05；与体外循环组比较，bP ＜0.05。W/D：湿/干重比；IQA：肺泡损伤数定量评价指标

2.3 血必净对体外循环大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞miRNA表达的影响

体外循环组大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞rno-miR-17-5p 表达较假手术组下降，差异有统计学意义（P ＜0.05）；而血必净组rno-miR-17-5p 高于体外循环组，差异有统计学意义（P＜0.05）。而体外循环组rno-miR-34a-5p 表达高于假手术组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；但是rno-miR-34a-5p 在体外循环组及血必净组差异无统计学意义（P ＞0.05）。其余候选miRNAs的表达在假手术组、体外循环组及血必净组差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图1。

图1 血必净对体外循环肺损伤大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞microRNA 表达的影响

3 讨论

体外循环是心脏直视手术的必要手段。尽管有先进的器官保护技术和术后严密监测，但体外循环术后的器官功能不全仍时有发生，而体外循环术后急性肺损伤是体外循环术后最常见的并发症之一[1]。

大量研究显示，在体外循环肺损伤中有复杂的细胞凋亡发生，其中由各种凋亡相关基因异常表达所致的肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡在体外循环肺损伤发病机制中发挥着重要作用，减轻肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡过度激活，可能是防治体外循环肺损伤的重要策略之一[12-13]。本研究采用生物信息学筛选了可能与肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡相关的miRNA。通过整合几种常用数据库中包含的大鼠miRNA 信息，然后进一步采用靶基因预测软件获得了候选miRNA 靶基因序列并分析候选基因的功能，筛选得到与肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡相关的miRNAs 5 条：rno-miR-17-5p、rno-miR-34a-5p、rno-miR-26a-5p、rno-miR-21a-5p 和rno-miR-375-3p。

现代药理学研究证实，血必净注射液可通过多种机制对急性肺损伤起保护作用[14-17]。本研究结果显示，与假手术组比较，体外循环组大鼠肺组织W/D 及QIA 升高，提示大鼠体外循环所致急性肺损伤模型制备成功。而血必净组W/D 及QIA 较体外循环组降低，表明经血必净注射液处理可以减轻体外循环诱导的急性肺损伤，血必净注射液可能是体外循环诱导的急性肺损伤的潜在治疗药物。

体外循环急性肺损伤归属于中医“暴喘”“喘脱”的范畴。研究已表明，体外循环肺损伤的基本病机为外邪犯肺、病位在肺肾，病机关键在于“热、瘀、水（湿）、虚”4 个方面[18-20]。而血必净注射液源于血府逐瘀汤，具有活血化瘀、清热解毒等功效。其功效与体外循环急性肺损伤的发生及中医防治机制的认识相吻合。然而血必净治疗体外循环急性肺损的机制尚不明确，还需要深入探索和研究。文献报道，血必净的有效成分可以调节不同细胞miRNA 表达[21]。因此本研究进一步检测血必净对体外循环肺损伤大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡相关候选miRNA 表达的影响。

本研究结果发现：体外循环组肺损伤大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞miR-17-5p 表达较假手术组下降，而miR-34a-5p 表达上调，差异有统计学意义（P ＜0.05）；血必净组miR-17-5p 较体外循环则组显著上升，差异有统计学意义（P ＜0.05）；但是miR-34a-5p 在体外循环组及血必净组差异无统计学意义（P ＞0.05）。研究显示，miR-17-5p 在胚胎肺上皮祖细胞中高表达，而且可以通过调节细胞周期调节基因Rbl2 表达调节肺上皮细胞分化和增殖[22]。研究还显示，miR-17-5p对肺血管内皮细胞及多种肿瘤细胞凋亡有调节作用[23-25]，本研究也显示，体外循环肺损伤大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞miR-17-5p 表达显著下降，而血必净组肺泡Ⅱ型上皮细胞miR-17-5p 表达较体外循环组显著上升。本研究推测血必净可以通过上调肺泡Ⅱ型上皮细胞miR-17-5p 表达抑制肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡，这可能是血必净治疗体外循环后急性肺损伤的机制之一。

但是血必净通过调控肺泡Ⅱ型上皮细胞miR-17-5p 表达抑制细胞凋亡发挥治疗体外循环急性肺损作用的靶点及机制尚需在后续工作中深入探索和研究。