Wnt信号通路在牙周组织及牙周炎中的调控作用

郑美慧 张志勇 张力辉 郝志华 杨韵煊

牙周炎在我国是一种高度流行的慢性口腔类疾病，它的病因复杂，是由菌斑微生物、宿主免疫反应以及环境和遗传因素等多方面相互作用的结果[1]，导致多种酶和细胞因子的释放，使牙龈、牙骨质、牙周膜和牙槽骨发生进行性破坏，最终不仅导致牙齿的脱落还会诱发一系列全身系统性疾病(糖尿病、心脑血管疾病、呼吸系统疾病等)[2]，严重影响了患者的正常生活，给患者造成了巨大的经济负担。Wnt信号通路被认为是生物体中最重要的信号通路之一，它不仅能够调节机体的生长、发育，还能控制细胞的增殖、分化、癌变和凋亡等生命历程。研究表明，此通路在口腔相关疾病(如牙周炎、牙髓炎、颌骨疾病、腭裂和牙齿发育异常等)均发挥了重要的调控作用[3]。Wnt信号通路在牙周组织的发育、牙周炎的进展以及牙周组织的修复再生领域发挥重要作用，Wnt蛋白的异常表达能导致炎性因子的产生以及骨代谢失调造成的牙槽骨吸收，加速了牙周炎的进程。本文对Wnt信号通路的组成及其在牙周组织和牙周炎中的调控作用进行综述。

1 Wnt信号通路

Wnt信号通路广泛存在于各种生物体中，是维持生物体生命活动最重要、最关键的信号通路之一，是调节胚胎发育、干细胞自我更新和分化的关键因素，参与器官和肿瘤发生、免疫炎性反应、骨代谢等一系列生理过程，与机体的炎症性疾病、癌症、骨代谢紊乱等紧密相关[4]。根据Wnt信号通路转导过程的不同，学者将它划分为以下两大类：一是经典Wnt/β-catenin信号通路，二是非经典Wnt信号通路[5]。

1.1 经典Wnt信号通路 经典Wnt信号通路由β-catenin介导，故又被称为Wnt/β-catenin信号通路，此通路与骨组织的修复和再生密切相关[6]。激活此信号通路是以Wnt配体(Wnt1、Wnt2、Wnt3a和Wnt7a等)为基础[7]，Wnt配体与七次跨膜蛋白(Frizzled)受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(low-density lipoprotein receptor- related protein 5/6，LRP5/6)[8]相结合，糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)的活性被抑制，同时β-catenin的磷酸化被阻断，随后β-catenin在细胞质中大量积累，并进入细胞核调控相关靶基因的表达[9]。在没有Wnt配体的情况下，Wnt信号通路处于关闭状态，由轴蛋白等构成的破坏复合物能够促进β-catenin磷酸化，最终β-catenin被蛋白酶泛素化并进一步降解[10]。

1.2 非经典Wnt信号通路 至少有2个通路参与介导非经典通路:Wnt/平面细胞极化通路(planar polarity cell pathway,PCP)和Wnt/Ca2+通路[11]。在非经典信号通路的传导过程中需要Frizzled，但不需要LRP5/6、β-catenin等的参与，多种分泌蛋白如Wnt4, Wnt5a,Wnt11等作为配体激活此通路。Wnt/PCP通路不但负责控制细胞极性，还能调控组织极性，并有利于细胞骨架的重组。Wnt配体与受体酪酸激酶样孤儿受体2 (receptor tyrosine kinase-like orphan receptors 2, Ror 2) 或相关受体酪氨酸激酶(related to receptor tyrosine kinase, RYK) 受体相结合,通过激活小G蛋白(GTPases)Rho和Rac等来发挥作用[12]。激活Wnt/Ca2+通路同样需要Wnt配体与受体相结合，加快细胞内Ca2+释放的速度，通过激活蛋白激酶C等来行使功能[13]。

2 Wnt信号通路对牙周组织发育的调控

研究表明牙源性外胚间充质和牙囊是牙周组织发生发育的基础，牙周组织在组织学上由牙骨质、牙周膜和牙槽骨组成[14]，Wnt信号通路的激活和关闭在调控牙周组织的发育、维持牙周组织的稳态中发挥了重要作用。在20世纪90年代末Thesleff等[15]，最早提出Wnt信号通路与牙齿的发育和稳态关系密切。

实验研究发现，早期牙源性间充质发育受到Wnt/β-catenin通路的影响，信号通路的中心成分β-catenin蛋白特异性失活导致了小鼠牙齿发育在胚胎期的停滞[16]。Xiang等[17]的研究中发现，向成骨培养基加入100 ng/ml 骨形态发生蛋白(BMP2)和300 ng/ml Wnt5a能显著促进小鼠新生磨牙牙囊干细胞的矿化程度。而Sakisaka等[18]发现在Wistar大鼠牙囊发育过程中，重组Wnt5a可能抑制Wnt3a介导的β-catenin/T细胞因子转录活性，在牙囊细胞成骨分化中发挥负向调控作用。Zhang等[19]研究小鼠的牙齿发育过程，去除成牙本质细胞和成牙骨质细胞中的β-catenin基因，观察到小鼠的无根磨牙和不完整切牙。磨牙牙冠及切牙唇侧结构完整，但磨牙牙根、切牙舌侧牙本质及牙周组织的形成严重受阻，提示β-catenin对于小鼠牙根及牙周组织的形成起着决定性作用。

Nemoto等[20]报道在小鼠牙根发育中，Wnt3a在上皮根鞘(HERS)细胞中高表达，同时小鼠牙囊细胞表达碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)等成骨因子，提示上皮根鞘细胞中可能通过激活经典Wnt信号通路来刺激牙囊细胞分化为成牙骨质或成骨细胞，从而促进牙根的生成。在小鼠牙骨质发育期间，国内学者报道成牙骨质细胞中的Wnt5a激活非经典Wnt信号通路，能够对牙囊的发育进行调节，促进牙囊形成牙骨质的进程[21]。Wnt信号通路同样能调控牙周膜，Gopinathan等[22]通过实验得出以下结论，该通路的主要拮抗剂分泌型卷曲相关蛋白1(Secreted Frizzled-Related Protein 1，sFRP1)在牙周膜成纤维细胞中显著表达，sFRP1能够保障牙周组织的矿化稳态，对牙周组织尤为重要。Lim等[23]研究报道，Wnt信号通路的激活剂Lrp5ACT处理小鼠，发现其成骨基因表达增加、破骨细胞活性降低以及牙槽骨形成增加，导致牙周膜间隙明显缩小，相反，Wnt信号通路的过量拮抗剂Ad-Dkk1处理小鼠时，其成骨标记物表达大幅度降低，破骨细胞活性明显增加，导致牙周膜增宽。Hasegawa等[24]对人牙周膜细胞进行机械刺激时，Wnt5a及其相关受体的表达上调，Wnt5a增强牙周膜细胞的增殖和迁移，但抑制牙周膜细胞的成骨分化。此外Wnt5a通过转化生长因子β1 (TGFβ1)上调骨膜蛋白(Periostin)的表达，增强了牙周膜中胶原蛋白的生成。这些发现提示，Wnt5a可能是维持牙周组织内环境稳态的关键因子，作为矿化的负调控因子，以阻止非生理矿化的发展；作为胶原蛋白生成的正调控因子，重塑牙周膜纤维形态，加速牙周膜纤维的成熟。Chang等[25]学者发现在牙槽骨发育期间，实验鼠牙囊间质细胞中所含有的骨形态发生蛋白刺激Wnt4，Wnt4可通过轴蛋白Axin激活 p38/MAPK通路，促进成骨细胞的增殖分化，进而显著上调牙槽骨形成相关蛋白如Ⅰ型胶原蛋白、特殊骨基质蛋白和骨钙蛋白的表达。

3 Wnt信号通路在牙周炎中的表达及意义

3.1 Wnt经典通路与牙周炎 Wnt经典信号通路的激活能降低牙周炎造成的牙周组织的损伤，发挥抗炎作用。Wnt3a蛋白是一个表达于多种真核细胞中的富含半胱氨酸的相对分子质量为4lku的分泌性糖蛋白，它作为Wnt经典信号通路的关键配体，不仅能抑制破骨细胞的增殖，而且能降低巨噬细胞的吞噬作用，减轻免疫炎性反应[26]。Lü等[27]发现，当8周的C57BL小鼠感染牙周病原菌牙龈卟啉单胞菌时，可增强其固有免疫细胞中Janus激酶3 (JAK3)的活性，使泛素E3连接酶Nedd4-2失活，阻碍Wnt3a泛素化降解，可以在一定程度上抑制炎性因子如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6 (IL-6)和白介素12P40 (IL-12P40)的产生，进而实现对牙周炎的控制，能够减轻机体的炎性反应。Liu等[28]检测牙周病组大鼠和健康组大鼠牙周组织和血浆中Wnt3a的变化，在2周、4周、6周对2组大鼠分别进行进行苏木精、伊红染色及抗酒石酸酸性磷酸酶染色，免疫组化和酶联免疫吸附试验检测牙周组织和血浆中Wnt3a，结果显示与健康组相比，牙周病组大鼠Wnt3a表达明显降低。程焕芝等[29]发现慢性牙周炎患者Wnt3a基因及蛋白的表达水平均较低，并且牙周指标(PPD、CAL)与Wnt3a的表达呈反比关系。由此可见，Wnt信号通路关键因子的异常表达可能与牙周炎的发生密切相关。Liu等[30]进行体外细胞实验，为了研究Wnt/β-catenin信号通路在炎症条件下对细胞外基质金属蛋白酶诱导剂/基质金属蛋白酶(Emmprin/MMPs)通路的影响，MMPs的异常表达可导致牙周结缔组织和骨组织的破坏。用牙龈卟啉单胞菌脂多糖(porphyromonas gingivalis lippopolysaccharide, Pg. LPS)处理人口腔上皮细胞/牙龈成纤维细胞的共同培养模型，利用Wnt3a激活此信号通路，双免疫荧光染色数据显示Emmprin和MMP-2,9的表达显著降低，而用Wnt通路抑制剂处理此共同培养模型是Emmprin和MMP-2,9的表达显著升高，由此推测，Wnt3a/β-catenin信号通路的激活能负向调控Emmprin/MMPs通路，减轻MMPs对牙周结缔组织和骨组织的破坏，降低牙周炎性反应。在炎症条件下，Wnt经典信号通路能与其他信号通路共同作用，组成一个复杂免疫调节网络，共同介导牙周炎的发展过程。

3.2 Wnt非经典通路与牙周炎 Wnt5a作为非经典Wnt信号通路的激活配体，在炎症性疾病中其可在干扰素γ(IFN-γ)或Pg.LPS的刺激下上调，促进IL-6、白介素8 (IL-8)等炎性因子的表达，在一系列病理变化中调节炎性反应[31]。在一项关于慢性牙周炎全基因组相关性的研究表明，Wnt5a基因与重度慢性牙周炎相关[32]。Chatzopoulos等[33]进行的一项横断面研究显示，中度和重度慢性牙周炎患者的病变部位(≥30%的位点PPD≥4 mm、CAL≥3 mm且存在探诊时出血)的龈沟液中Wnt5a总蛋白水平明显高于健康部位。Haftcheshmeh等[34]发现慢性和侵袭性牙周炎患者牙龈组织中Wnt5a mRNA的表达明显高于健康人，其中侵袭性牙周炎患者Wnt5a mRNA表达水平最高，同时Wnt5a mRNA表达水平与PPD、CAL等临床参数呈正相关。Maekawa等[35]分别检测牙周炎患者和健康个体牙龈组织中的Wnt5a和非经典通路拮抗剂 sFRP5mRNA的表达水平，发现牙周炎患者组织中Wnt5a的表达显著高于健康个体，而sFRP5的表达则相反。同时，学者又进行了动物实验研究，它们将实验性牙周炎小鼠分成4组，分别将PBS缓冲液(对照组)Wnt5a(0.2 μg)、sFRP5(0.2 μg)和Wnt5a+sFRP5联合微注射至结扎的上颌第二磨牙的腭侧牙龈，分别观察实验小鼠的牙槽骨吸收情况：微注射Wnt5a的牙槽骨骨吸收显著增加;微注射sFRP5显著抑制小鼠的骨吸收；Wnt5a+sFRP5联合微注射，骨吸收也能被sFRP5显著抑制。由此可见，Wnt5a启动Wnt非经典信号通路，促进了牙周炎的发生发展，而此通路的拮抗剂sFRP5能发挥抗炎作用，抑制促炎因子(IL-1β、IL-6和IL-17)的表达，阻止牙周炎的进展，进一步抑制牙槽骨吸收。Qian等[36]研究了早期实验性牙周炎小鼠牙龈组织中和体外培养的经Pg. LPS处理的牙周膜细胞中钙调素依赖性激酶Ⅱ (CaMKⅡ)和骨膜蛋白(Periostin)表达，发现Wnt5a、CaMKⅡ和Periostin的表达显著升高。Wnt5a能明显提高CaMKII总蛋白和Periostin的表达，提示Wnt5a可在牙周炎早期通过Wnt5a/CaMKII途径上调下游分子Periostin，促进牙周膜胶原纤维的形成与重构，促进牙周组织修复，以维持牙周组织的内环境稳定与矿化稳态，这应该是机体在牙周炎早期免疫防御和修复机制的反映。

4 Wnt信号通路在骨代谢中的作用

牙周炎是由于骨代谢紊乱引起的一种炎症性疾病，牙槽骨的进行性破坏吸收为其最主要临床表现，学者们认为Wnt信号通路是参与调节机体成骨与破骨的一个关键的信号通路，与骨质疏松、骨癌等疾病关系密切[37]，因此该通路的关键蛋白的成为了骨代谢相关疾病的治疗靶点。有研究发现，Wnt信号通路与其他骨代谢相关通路相互作用，如通过调控下游细胞核因子κb受体活化因子配体/细胞核因子κb受体活化因子/骨保护因子(RANKL/RANK/OPG)信号通路，降低破骨细胞的增殖分化，从而实现抑制骨吸收的结果[38]。

Wnt信号通路的激活可以有效调节牙周组织的成骨与破骨平衡，实现骨稳态。Wu等[39]研究表明，在小鼠牙槽骨细胞和牙骨质细胞中，持续过表达的β-catenin可导致牙周膜钙化，使牙齿变得强直。Wang等[40]发现，人类脱落乳牙的外泌体(SHED-Exos)通过正向调控Wnt3a及(BMP2)，可以明显促进牙周组织的成骨分化[41]。

骨硬化蛋白(Sclerostin，SOST)和骨吸收因子Dickkopf相关蛋白-1(Dkk-1)能竞争性地结合LRP5/6并进一步阻止Wnt配体与相关受体的结合，是Wnt信号通路的主要拮抗剂，能显著抑制Wnt信号通路后续的转录和翻译[41]，对骨形成具有强有力的负面作用，从而促进牙周炎的进展。

Chatzopoulos等[33]报道，SOST蛋白在广泛性中、重度慢性牙周炎亚组龈沟液中的表达水平显著高于健康组。Kim等[42]进行了牙周炎大鼠的相关性研究，将大鼠分成牙周炎组和对照组，下颌骨第一磨牙结扎致牙周炎。结扎后1、3、10和20 d，对磨牙分叉处的牙槽骨(AB)和类骨质区域进行组织学分析，通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色和免疫组化检测破骨细胞的数量和骨细胞表达RANKL、SOST的情况。结果显示AB缺失伴随着破骨细胞形成的增加和类骨质形成的抑制。当破骨细胞形成增加时，骨细胞表达RANKL；当类骨形成受到抑制时，骨细胞表达SOST增加；相反，当类骨形成增加时，骨细胞SOST表达减少。这些结果提示，在牙周炎性反应中，炎性因子可分别通过刺激骨细胞表达RANKL和SOST，促进骨吸收的增加和骨形成的减少。随后Kim等[43]更深一步进行了SOST的相关研究，他们设置了牙周炎大鼠组(P组)和糖尿病合并牙周炎大鼠组(DP组)，在第3天观察到2组大鼠类骨质形成受到抑制，同时骨细胞表达SOST和TNF-α增加，但在第20天DP组出现持续的类骨质形成抑制，骨细胞表达SOST维持在较高的状态，而P组类骨质形成增加，SOST的表达呈下降趋势。因此，炎性因子TNF-α和骨硬化蛋白的提高导致了骨形成减少，并且糖尿病通过加速TNF-α的产生加剧了牙槽骨的吸收。有的学者研究认为，一些炎症性疾病产生的TNF-α等促炎因子能通过上调RANKL的表达，从而诱导骨细胞SOST的表达，进而加速骨吸收[44]。

Liu等[28]报道了实验性牙周炎大鼠和健康大鼠牙周组织和血浆中Dkk-1随着时间延长的变化，结果显示与健康组相比，实验组Dkk-1的表达呈时间依赖性显著升高。Goes等[45]将具有实验性牙周炎的骨细胞特异性Dkk-1敲除的小鼠作为实验组，Dkk-1保留的小鼠作为对照组，通过Micro-CT和组织学分析显示：与对照组相比，实验组小鼠牙槽骨体积、骨密度、骨小梁数量和厚度均高于对照组；此外在其上颌牙龈组织中炎性因子TNF-α和IL-1以及RANKL的表达减少，破骨细胞减少，成骨细胞分化的关键转录调节因子Runx2和骨钙蛋白的表达增加。提示在Dkk-1特异性敲除实验组小鼠成骨细胞中，Wnt信号通路被激活，进而调节成骨分化相关的靶基因的表达。

SOST和Dkk-1作为骨代谢相关疾病的治疗靶点，能显著促进骨的再生与修复。Liu等[46]研究表明，建立去除大鼠卵巢雌激素缺乏模型和大鼠上颌磨牙拔除模型中，单独注射骨硬化蛋白抗体(SAB)或与DKK1抗体(DAB)联合注射，激活Wnt信号通路，均能减缓大鼠颌骨吸收的进程。在炎症条件下，Taut等[47]给实验性牙周炎大鼠注射了硬化蛋白中和单克隆抗体，6周后通过测量骨体积分数、组织矿物质密度及血清中的成骨相关标志物，发现上颌骨的缺损得到了明显改善。

5 Wnt信号通路在牙周组织再生中的作用

牙周炎未经治疗可导致牙周组织破坏和牙齿脱落。现阶段，实现牙周软硬组织的重建与再生成为目前的治疗目标。近年来，牙周组织工程研究热点在于促进牙周膜细胞的分化再生水平[48]。牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)是科学家从牙周膜中分离提取得到的一种新型间充质干细胞，以其强大的自我更新能力及多向分化能力得到了越来越多的学者的青睐[49]，在牙周组织再生修复领域中，学者们将PDLSCs视为是最具有应用前景与发展潜力的种子细胞。

经典Wnt/β-catenin信号通路和非经典Wnt信号通路均能调控PDLSCs的自我更新及分化，进而修复缺损牙周组织。Rahman等[50]报道，阿司匹林能使PDLSCs中Wnt经典信号通路上调，调节PDLSCs生长因子相关基因的表达，并提高其成骨的潜能。据毛杰等[51]报道，由雌激素(estrogen)和外源性的Wnt3a蛋白介导的PDLSCs成骨诱导组，Wnt/β-catenin信号通路被激活，相关成骨标记物指标(ALP、Runx2、OCN)的表达明显高于单纯成骨诱导组。Xing等[52]用来自大肠杆菌的低浓度脂多糖LPS(0.5 μg/ml)的刺激PDLSCs，不影响PDLSCs的增殖但能改变PDLSCs的细胞活性和细胞周期，显著提高ALP的活性及相关成骨基因的表达，正向调控PDLSCs成骨分化。此外，该学者发现LPS通过增强具有PDZ结合基序的转录共激活因子(TAZ)活性，促进PDLSCs成骨分化。TAZ作为Wnt信号通路的下游蛋白，它通过激活成骨细胞分化和抑制脂肪细胞分化从而调节间充质干细胞的分化。Liu等[53]报道，在PDLSCs成骨诱导培养基中，协同降低β-catenin的表达水平，发现PDLSCs中Wnt/Ca2+信号通路的相关蛋白CaMKlI、Nemo样激酶等表达水平与PDLSCs的成骨分化呈正相关。此外，科学家发现在新型生物材料的应用领域，如微纳米杂化结构的羟基磷灰石生物陶瓷[54]和四面体DNA纳米结构[55]通过Wnt信号通路显著促进PDLSCs成骨分化，可作为牙周组织工程的新型移植材料。在药物研究领域，我国的中草药黄芩苷[56]、木犀草素[57]以及芍药内酯苷[58]等均能通过活化Wnt信号通路促进PDLSCs成骨分化，以后可能应用于临床中，作为牙周炎的辅助治疗药物。

一些实验研究结果显示Wnt信号通路均能促进牙周组织的再生与修复，但是部分实验表明，Wnt信号通路对于牙周组织再生具有相反的效果。崔晓霞等[59]研究发现，与正常的人PDLSCs相比，由高级糖基化终产物(AGEs)刺激的人PDLSCs，其骨形成特异性基因(ALP、Runx2、BSP)的表达以及矿化结节的产生均显著降低。Hasegawa等[60]研究发现，在成骨诱导条件下，Wnt5a通过激活Ror2/JNK信号通路抑制人PDLSCs中骨形成相关因子(ALP、BSP和Osterix)的表达，减少茜素红染色阳性矿化结节的形成，提示Wnt5a负向调控PDLSCs的成骨分化。Han等[61]用Li-MBG生物支架培养基培养人牙周膜干细胞，发现Li离子通过激活人PDLSCs中的Wnt经典信号通路及SHH信号通路，从而促进人PDLSCs细胞增殖和成骨分化相关基因的表达，提示Li离子通过上调Wnt经典信号通路正向调控PDLSCs的增殖及成骨分化。而廖海清等[62]报道，用不同浓度的LiCl刺激人牙周膜细胞后，发现ALP活性及细胞增殖均降低，且LiCl浓度越高，降低程度越明显，表明用较高浓度的LiCI激活Wnt信号通路，下调人牙周膜细胞成骨分化及增殖。Liu等[63]研究显示PDLSCs的成骨分化在炎症环境下可被Wnt信号通路抑制,而作为Wnt信号通路的拮抗剂Dkk-1，可促进来自炎症环境中PDLSCs的增殖分化，并挽救受损PDLSCs的成骨潜能[64]。

目前由于Wnt信号通路对牙周组织再生的具体影响尚不确定，我们应当加强对Wnt信号通路的研究，进一步探究其对牙周组织再生修复的具体机制，在临床中谨慎应用新型的生物材料及相关药物。

6 总结与展望

综上，作为生命体最重要信号通路之一的Wnt信号通路参与调控了牙周组织的发生发育，在牙周炎的发生发展、骨代谢和牙周组织再生领域中均发挥了重要作用；此外，Wnt信号通路并非孤立地发挥作用，经典与非经典通路之间、Wnt信号通路与其他信号通路之间都能产生相互作用，构建出相对复杂、准确度较高的调控网络，确保机体生命活动的正常运行。