超声辅助离子液体混合溶剂提取甘薯叶片多酚物质

张文婷，孙健，徐飞，朱红，岳瑞雪，张毅，马晨，钮福祥

(江苏徐淮地区徐州农业科学研究所 中国农业科学院甘薯研究所，江苏 徐州 221131)

甘薯叶片中含有丰富的维生素、蛋白质、矿物质等营养成分，具有提高人体免疫力、促进胆固醇的排泄、防止心血管脂肪沉积等保健功能[1-2]。甘薯叶片中含有大量的多酚类物质，包括酚酸、花青素和类黄酮等[3]。多酚类物质具有清除自由基、抗氧化、抗动脉硬化、抗衰老和防治心血管疾病等多种生理功能[4-5]，随着“追求天然”消费观念的兴起，植物多酚作为纯天然提取物深受人们的喜爱，在制药、生化、食品及精细化工等领域发挥着越来越重要的作用。

室温离子液体(RTILs-room temperature ionic liquids，IL)是指室温范围或100 ℃以内可呈现为液态的熔融盐[6]，具有理化性质稳定、萃取能力好、可重复利用等特殊性质。由于其具有优良的特性，是许多化学反应、活性物质提取中用到的优良溶剂。IL可与植物中的某些化学成分进行偶极-偶极相互作用、氢键作用及疏水作用等，因此，可用其对植物中的有效成分进行提取和分离。研究表明，少量IL添加可提高乙醇/硫酸铵ATPS的分相能力及其对茶多酚的得率，咪唑型IL对提取茶多酚具有更好的促进作用[7]。王刚等[8]优化了微波辅助IL提取石上柏穗花杉双黄酮工艺，最佳提取条件为：提取溶剂为2.0 mmol·L-1[C6MIM] [PF6]溶液，料液比1∶15 (g·mL-1)，微波功率500 W，提取时间39 min，提取温度46 ℃。苏适等[9]研究表明，黑豆异黄酮的最佳提取条件为IL浓度为0.75 mol·L-1、料液比1∶23 (g·mL-1)、提取温度50 ℃、提取时间40 min，在此条件下黑豆异黄酮的提取率为0.419%。可见在用IL对植物中的有效成分进行提取时，可提高有效成分的提取效率。

目前用绿色溶剂离子液体提取甘薯叶片多酚的研究鲜有报道。本研究以漯薯11号甘薯叶片为试验材料，将离子液体与70%乙醇组成混合溶剂用于甘薯叶片多酚的提取，探究了最优的离子液体类型和提取条件，为甘薯叶片多酚的进一步开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

漯薯11号甘薯品种种植于中国农业科学院甘薯研究所试验田(117°17.48′E，34°16.95′N)。没食子酸对照品和离子液体(萨恩化学技术有限公司)；福林-酚显色剂(合肥博美生物科技有限责任公司)；无水乙醇等所有试剂均为国产分析纯，水为蒸馏水。

1.2 主要仪器

UV-2450紫外分光光度计(日本岛津公司)；ALPHA1-4LD plus冷冻干燥仪(德国Christ公司)；DK-S26恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；JA3003电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)；YP1002N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；DHG-9246A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。

1.3 实验方法

标准曲线的制定参考刘丽香[10]的方法。多酚物质的提取和测定参考衣申艳[11]的方法并进行改进：准确称取1.00 g叶片粉末至150 mL锥形瓶，加入IL-70%乙醇混合溶液，超声条件下(50 ℃，功率为100 W)浸提，过滤，冷却后离心(转速为4 000 r·min-1)20 min，收集上清液定容至150 mL容量瓶中作为待测提取物。将待测溶液稀释，精确吸取稀释液0.2 mL，加入1.0 mL 10%(V/V)福林-酚溶液和2.8 mL 7.5%(m/V)碳酸钠溶液，混合均匀后，在30 ℃水浴锅中避光条件下反应30 min，随后立即测定760 nm处吸光度值，每个处理重复3次。

1.4 数据处理

试验数据以3次以上结果的平均值表示，并采用SPSS 17.0软件和Excel 2007软件分析整理数据。

2 结果与分析

2.1 IL的筛选

2.1.1 不同类型IL对多酚提取率的影响

选择4种不同类型的IL(吡咯烷类、咪唑类、吡啶类和哌啶类)：溴化N-丁基-N-甲基吡咯烷([BMPyrr]Br)(a)、溴化1-乙基-3-甲基咪唑([BMIM]Br)(b)、溴化1-乙基吡啶([EMIM]Br)(c)和溴化N-丁基-N-甲基哌啶([C4MPd]Br)(d)对多酚提取率的影响。由图1可知，4种类型IL对多酚提取效果的影响大小顺序为咪唑类>吡啶类>吡咯烷类>哌啶类。咪唑环阳离子相比其他3种类型IL，具有更高的多酚得率，这主要是由于咪唑环属于芳香环，具有π电子，可以和多酚发生π-π电子共轭作用，此外咪唑环上含有2个N原子，与多酚组分形成的氢键作用更大[12]。

图1 IL类型对多酚提取率的影响

2.1.2 不同阴离子型咪唑类IL对多酚提取率的影响

选用1-乙基-3-甲基咪唑为阳离子，考察4种不同类型的阴离子IL：溴化1-乙基-3-甲基咪唑([EMIM]Br)(b)、硫酸乙酯1-乙基-3-甲基咪唑([EMIM]Es)(e)、碘化1-乙基-3-甲基咪唑([EMIM]I)(f)、醋酸1-乙基-3-甲基咪唑([EMIM]Ac)(g)对多酚提取率的影响。如图2所示，[EMIM]Br对多酚的提取效果最好，可能原因是[EMIM]Br与乙醇分子之间的强作用力使得IL溶液能有效渗透到植物细胞中，从而提高了多酚的溶解度。

图2 阴离子类型对多酚提取率的影响

2.1.3 不同阳离子类型IL对多酚提取率的影响

选用溴离子为阴离子，考察4种不同链长的咪唑阳离子溴盐：1-乙基3-甲基咪唑离子([EMIM]Br)(b)、1-丁基3-甲基咪唑离子([BMIM]Br)(h)、1-己基3-甲基咪唑离子([HMIM]Br)(i)、1-辛基3-甲基咪唑离子([OMIM]Br)(j)对多酚提取率的影响。如图3所示，随着阳离子烷基链长度从乙基增大到丁基，多酚提取率呈现升高趋势，这可能是由于IL对多酚的氢键作用和疏水作用逐渐增强；当阳离子链长从丁基增大到辛基时，提取率逐渐下降，这可能是由于IL的黏度增加，导致其溶剂化作用减弱；同时IL分子链长度增加导致空间位阻增加，使得IL分子与多酚化合物之间的接触减少。另外，碳链长度越长，离子液体的极性越小，在提取天然药物有效成分时，应根据相似相溶原理选择合适的离子液体。

图3 阳离子类型对多酚提取率的影响

综合以上实验结果，可确定对甘薯叶片中多酚物质提取效果最佳的IL为[BMIM]Br，并选择该IL进一步做单因素考察。

2.2 单因素实验

2.2.1 离子液体浓度的影响

IL浓度是影响植物有效成分提取率的主要因素，为寻找最佳IL浓度，考察了一系列不同的IL浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol·L-1)对多酚提取率的影响。

图4所示，当IL浓度逐渐增大时，多酚提取率呈现先上升后下降的趋势，IL浓度在0.4 mol·L-1时多酚提取率最高。随着IL浓度增加，IL的黏度增加导致IL溶液的扩散能力降低，IL溶液较难渗透到植物细胞组织中，而不能充分地从植物中提取目标化合物[13]。

图4 IL浓度对多酚提取率的影响

2.2.2 提取时间的影响

本次研究在其他参数不变的情况下，考察了提取时间(10、20、30、40、50、60 min)对多酚提取率的影响。由图5可知，随提取时间的不断增长，多酚提取率呈现增长趋势，说明超声波的机械效应和空化效应能在较短的时间内破碎植物细胞，使得位于细胞间和细胞壁的多酚溶解出来[14]。当提取时间为40 min时，提取率达到最大值，但时间超过40 min，提取率开始降低。其原因可能是随着处理时间的延长，植物组织细胞内大量不溶物及黏性物质等混入提取液中，使溶液中杂质增多，黏度增大，从而增加了传质阻力，影响多酚成分的溶出。因此，提取时间选择40 min。

图5 提取时间对多酚提取率的影响

2.2.3 料液比的影响

溶剂与原料的比率是影响多酚提取效果的关键因素，改变料液比可改变溶剂和原料之间的接触面积。本研究设定的料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45 g·mL-1，图6所示，随着料液比的增加，多酚提取率呈上升趋势并在1∶40 g·mL-1时达到最高，随后下降。可能原因是当料液比过大时，叶片内部脂溶性物质会更多地溶出，而与多酚类物质产生竞争[15]。因此，合适的料液比选择为1∶40 g·mL-1进行后续试验。

图6 料液比对多酚提取率的影响

2.3 离子液体的回收

先将提取物用热水100 mL溶解，用等体积的乙酸乙酯萃取3次；合并萃取后的离子液体水溶液，减压浓缩得到离子液体[BMIM]Br，将其在60 ℃下真空干燥至恒重即可。

3 小结

考察了不同IL类型(包括不同阴离子和阳离子IL)对甘薯叶片中多酚提取率的影响，得出最佳的IL为[BMIM]Br；通过考察IL浓度、提取时间、料液比对甘薯叶片多酚提取率的影响，得出最佳的提取条件为[BMIM]Br浓度为0.4 mol·L-1、提取时间为40 min、料液比为1∶40 g·mL-1。在最优条件下多酚的提取率为55.614 mg·g-1，高于常规方法47.577 mg·g-1[16]。离子液体种类多、结构杂，其他不同结构组成离子液体对多酚得率及其影响机制，有待进一步研究。