糖尿康胶囊质量标准提升研究

胡 静 许建秦 陈志永 任 慧 张晓凤*

1.陕西省中医药研究院，陕西 西安 710061；2. 陕西省中医医院，陕西 西安 710003

糖尿康胶囊是陕西省中医医院(以下简称“我院”)肾病科常用的院内制剂(陕药管制字[2001]第0022号)。糖尿康胶囊由西洋参、地黄、麦冬、天花粉、地骨皮、红花、制何首乌、僵蚕、鹿角霜等九味药材组成，具有滋阴益气、活血通络的功效。临床上常用于消渴病，对烦渴多饮，消瘦多尿，乏力多汗及肢体麻木疼痛等症疗效确切[1]。其现行标准只有西洋参PanaxquinquefoliumL.的薄层色谱鉴别，专属性差，无法控制糖尿康胶囊的质量。我院作为糖尿康胶囊的使用单位，研究起草了糖尿康胶囊的质量标准，定性鉴别在原标准的基础上增加了地黄RehjnanniaglutinosaLibosch.、天花粉TrichosantheskirilowiiMaxim、地骨皮Cortex Lycii的薄层色谱鉴别，同时定量分析了2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量，并且据3批样品的测定结果，确定其相对合理的含量限度，以期尽量全面反映和控制糖尿康胶囊的质量，从而确保其临床合理应用和疗效。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent科技有限公司)，配备四元泵、VWD检测器、自动进样器、柱温箱和Agilent ChemStation for LC Systems工作站；KQ-400DE型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；BS210S万分之一电子分析天平(赛多利斯科学仪器〔北京〕有限公司)等。Agilent TC-C18(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)色谱柱(美国Agilent科技有限公司)。

1.2 试药 糖尿康胶囊(批号：20190601、20191101、20200901，陕西省中医医院制剂中心)；2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品(批号：MUST-16021005，购自中国食品药品检定研究院)。薄层层析硅胶G(批号：20200821，青岛海洋化工有限公司)和羧甲基纤维素钠(批号：20200713，国药集团化学试剂有限公司)为化学纯试剂，乙腈和甲醇为色谱纯试剂(美国赛默飞世尔科技公司)，水为屈臣氏蒸馏水，其他均为分析纯试剂。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱(thin layer chromatography, TLC)鉴别

2.1.1 地黄TLC鉴别[2-3]129取糖尿康胶囊10粒，去掉胶囊壳，将内容物研细，加入50 mL水，加热至微沸，冷却，过滤，用乙酸乙酯提取滤液3次，每次30 mL，将乙酸乙酯溶液合并，水浴蒸发至干燥，加入1 mL甲醇溶解残渣，用作供试品溶液。另取2 g地黄对照药材，加入30 mL水，以同样的方法制备地黄对照药材溶液。取缺少地黄的阴性样品，以同样方法制成缺地黄阴性对照溶液。按照2020年版《中国药典》四部通则0502项下“薄层色谱法”试验，分别吸取供试品溶液及缺地黄阴性对照溶液各5 μL、地黄对照药材溶液3 μL，在同一块硅胶G薄层板上点样，用乙酸乙酯-甲酸-甲醇(16∶2∶0.5)作为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。结果显示，在供试品色谱中，与地黄对照药材色谱相应的位置处，显蓝色的荧光斑点一个，缺地黄的阴性对照色谱无干扰。如图1所示。

1 2 3 4 51～3：三批样品(批号：20190601,20191101,20200901)；4：对照药材：5:缺地黄阴性对照图1 地黄薄层色谱图

2.1.2 天花粉TLC鉴别[2]57取糖尿康胶囊10粒，去掉胶囊壳，将内容物研细，加20 mL稀乙醇，室温下超声处理30 min(250 W，50 Hz)，滤过，滤液水浴上浓缩至0.5 mL。取缺少天花粉的阴性对照样品，采用同样方法制成缺天花粉阴性对照品溶液。另取2 g天花粉对照药材，采用同样方法制成天花粉对照药材溶液。再取瓜氨酸对照品加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为瓜氨酸对照品溶液。按照2020年版《中国药典》四部通则0502项下“薄层色谱法”试验，分别吸取供试品溶液和缺天花粉阴性对照溶液各3 μL、天花粉对照药材溶液2 μL、瓜氨酸对照品溶液1 μL，在同一块硅胶G薄层板上点样，用正丁醇-无水乙醇-冰醋酸-水(8∶2∶2∶3)作为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。结果显示，供试品色谱中，在与天花粉对照药材和瓜氨酸对照品色谱相应的位置上，显玫红色的主斑点一个，缺天花粉的阴性对照色谱无干扰。如图2所示。

1 2 3 4 5 61～3：三批样品(批号：20190601,20191101,20200901)；4：对照药材；5：瓜氨酸；6：缺天花粉阴性对照图2 天花粉薄层色谱图

2.1.3 地骨皮TLC鉴别[2]128取糖尿康胶囊10粒，去掉胶囊壳，将内容物研细，置于锥形瓶中，加甲醇15 mL，室温下超声30 min(250 W，50 Hz)，过滤，滤液水浴蒸发至干燥，加入1 mL甲醇溶解残渣，用作供试品溶液。另取1.5 g地骨皮对照药材，采用同样方法制成地骨皮对照药材溶液。取缺少地骨皮的阴性样品，采用同样方法制备缺地骨皮阴性对照品溶液。按照2020年版《中国药典》四部通则0502项下“薄层色谱法”试验，分别吸取供试品溶液、缺地骨皮阴性对照溶液和地骨皮对照药材溶液各6 μL，在同一块硅胶G薄层板上点样，采用甲苯-甲酸-丙酮(10∶0.1∶1)做为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外光灯(365 nm)下检视。结果显示，供试品色谱中，在与地骨皮对照药材色谱相应的位置上，显1个相同的蓝色荧光斑点，缺地骨皮阴性对照无干扰。如图3所示。

12 345 61～3：三批样品(批号：)；4、5：对照药材；6：缺地骨皮阴性对照图3 地骨皮薄层色谱图

2.2 糖尿康胶囊中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的定量检测

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 采用十八烷基硅烷键合硅胶做为填充剂，色谱柱：Agilent 5 TC-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇(B)-0.1%磷酸水溶液(D)梯度洗脱(0～5 min，2%B；5～10 min，2%～5%B；10～25 min，5%～15%B；25～50 min，15%～30%B；50～80 min，30%～60%B)，柱温为30 ℃，检测波长为320 nm，流速为1.0 mL/min。按2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰计算理论塔板数不低于2000。

2.2.2 溶液的制备

2.2.2.1 对照品溶液的制备 精密称定2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.1188 mg的溶液，即得。

2.2.2.2 供试品溶液的制备 取糖尿康胶囊20粒，除去胶囊壳，混匀，研细，取约1.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50 mL的70%乙醇，常温下超声(250 W，50 kHz)提取30 min，放冷，重新称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 测定波长的选择 取2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液在200 ～400 nm范围内进行紫外扫描，结果最大吸收在320 nm处，同时结合2020年版《中国药典》一部何首乌项下[2]129内容，确定320 nm为检测波长。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 专属性实验 取缺制何首乌的阴性样品，按照“2.2.2”项下制备制何首乌阴性对照品溶液，取“2.2.2”项下对照品溶液1 μL和供试品溶液5 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定。结果显示，阴性对照无干扰，专属性强。如图4所示。

2.2.4.2 线性关系考察 精密量取“2.2.2”项下2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液0.1 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL、5 mL、10 mL分别置于10 mL量瓶中，按照“2.2.1”项下色谱条件测定。以峰面积为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)，进行线性回归，得到回归方程为Y=2.6834X-6.1472，相关系数r为0.9999，表明2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在1.188～594 μg·mL-1范围内，峰面积值与进样量线性关系良好。

2.2.4.3 精密度实验 取“2.2.2”项下对照品溶液1 μL，按照“2.2.1”项下色谱条件重复进样6次，计算2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰面积的RSD。结果2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰面积RSD为1.34%小于2.0%，表明仪器有良好的精密度。

1:2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷；A：对照品溶液;B：供试品溶液;C：缺制何首乌阴性对照品溶液图4 高效液相色谱图

2.2.4.4 重复性试验 取同一批糖尿康胶囊(批号：20191119)样品，按“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，按照“2.2.1”项下色谱条件测定。结果2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的平均含量为0.58 mg/g，RSD为0.55%，表明该方法有良好的重复性。

2.2.4.5 稳定性试验 取同一批糖尿康胶囊(批号：20191119)样品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分别在室温下放置0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、18 h、21 h、24 h时进样测定，结果2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的峰面积的RSD为1.01%，表明供试品溶液在24 h内有良好的稳定性。

2.2.4.6 加样回收率试验 精密称取已知2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量的糖尿康胶囊(批号：20191119)样品六份，每份0.5 g，置100 mL量瓶中，分别精密加入比例为1∶1的2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(mg/mL)对照品适量，依照“2.2.2”项下方法制备供试品，以“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算供试品中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的平均加样回收率为98.18%，RSD值为2.41%，表明加样回收符合要求。具体结果见表1。

2.2.5 样品含量测定 取3批样品分别精密称取适量，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算3批样品中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量。结果见表2。

2.3 含量限度的确定 根据表2中3批样品含量测定的结果，考虑到药材的来源，以及制剂生产、贮藏等因素，故暂定本品含2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷不得少于三批样品含量均值的80%即0.4390 mg/g。

表1 2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷回收率试验结果 (n=6)

表2 样品中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量测定结果

3 讨论

3.1 TCL条件筛选 糖尿康胶囊的TCL中地黄、天花粉、地骨皮是新增项，首先参考的是2020年版《中国药典》一部中地黄[2]129、天花粉[2]57、地骨皮[2]128“鉴别”项下薄层鉴别，发现天花粉和地骨皮供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。但是按照药典方法对糖尿康胶囊中地黄药材的TCL鉴别供试品和对照药材斑点不能一一对应，后参照文献[3]的样品处理方法，并对展开剂进行了调整，最终确定了文中地黄药材的TCL鉴别方法。

3.2 HPLC条件筛选 指标性成分选取：2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷是制何首乌中二苯乙烯苷类成分，是2020年版《中国药典》一部“制何首乌”含量测定项下测定成分之一[2]183。现代药理研究[4]表明二苯乙烯苷类对2型糖尿病大鼠具有抑制炎症、减轻氧化应激，减少胰岛素抵抗和糖、脂肪代谢的异常,并能显著降低骨骼肌中甘油三酯和游离脂肪酸的作用[5-6]。且糖尿康中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量较其他已知成分高(注：10.22min和22.66 min处经对照品比对确认分别为没食子酸和原儿茶酸，在此两处转换波长分别为273 nm[2]68和260 nm[7]含量依然很低，无法进行质量控制)及峰型好、与相邻峰分离度大于1.5且阴性无干扰，故选择其作为含量测定的指标性成分。

流动相：在摸索2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量测定方法时参考了2020年版《中国药典》一部“制何首乌”含量测定项下色谱条件及文献[2]183[8]，分别考察了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸，甲醇-0.1%磷酸等不同配比作为流动相进行等度和梯度洗脱。结果显示，仅乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱可以对2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷与样品中其他峰得到较好的分离，且流动相本身干扰小，基线平稳，故选择乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱。

提取溶剂和提取方法：考察了水、乙醇(10%、30%、50%、70%、90%、100%)、甲醇(10%、30%、50%、70%、90%、100%)等溶剂的提取效果，采用70%乙醇提取时得率最高，测定无干扰，2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰与相邻杂质峰分离度均在1.5以上，故提取溶剂采用70%乙醇。同时考察了超声处理(250 W，50 kHz)、加热回流2种提取方法的效果，结果显示，超声提取和加热回流提取对2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量的影响相似，但超声提取操作简单易行，故采用超声提取；以70%乙醇为溶剂时，考察了超声处理(250 W，50 kHz)10 min、20 min、30 min、40 min、50 min对2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷提取效果的影响，发现超声30 min时基本提取完全，故提取时间选择30 min。

本研究在糖尿康胶囊原质量标准仅有西洋参TLC定性鉴别的基础上增加了地黄、天花粉、地骨皮TLC定性鉴别和2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷HPLC定量检测，所建立的TLC方法简便、专属性强，HPLC方法稳定性好、精密度高，结果准确可靠，可用于糖尿康胶囊的质量控制并提升其质量标准。