植物乳杆菌KSFY04通过调节核因子κB信号通路干预小鼠血栓形成的效果

赵 欣，刘 佳，易若琨,2，骞 宇，杨贞耐

（1.重庆第二师范学院 重庆市功能性食品协同创新中心，重庆 400067；2.北京工商大学 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京 100048）

我国新疆地区幅员辽阔，畜牧业发达，拥有大量优质牧场。同时，新疆地区少数民族众多，各少数民族都有自己较为独特的饮食习惯，但是大部分均有食用乳制品的习惯。牧民家庭制作的自然发酵酸乳是最常食用的乳制品之一[1]。因为新疆少数民族牧民有食用自然发酵酸乳的习惯，这些自然发酵乳制品中的微生物经过上千年的自然驯化，已经适应了新疆的生存环境并且具有不同的发酵特性及益生功能，极具开发利用价值[2-3]。

经济发展促进了我国国民生活水平的提高，也使居民饮食结构发生变化，大量不健康食品的摄入易造成心脑血管疾病等多种慢性疾病的发病率增加，严重威胁中老年人的身体健康[4]。心脑血管疾病具有突发性特点，发病突然、及时救治困难，严重威胁患者的生命[5]。内源性或外源性损伤引起的血液流动异常是引发心脑血管疾病的重要因素，进而加剧机体发生炎症反应[6]。而炎症也是诱发血栓形成的一个重要因素，同时血栓形成又会进一步加剧炎症[7]。血栓会对机体器官造成一定损伤，随着后续炎症和血栓程度的加剧，机体器官损伤程度随之加剧[8]。严重的血栓会导致复杂炎症，使肝脏、肾脏等多器官发生功能障碍和组织坏死[9]。炎症状态下，大量促炎因子使血液处于高凝状态，引起血栓形成；同时血栓又会加剧机体炎症的发生和发展，炎症和血栓的交互作用形成复杂网络，造成心脑血管等器官和组织的严重损伤[10]。

角叉菜胶能够引发实验动物体内的炎症反应，大量炎症因子会快速进入血液循环，从而引发血管内皮细胞损伤或死亡，并最终导致血栓的形成。鼠尾血管是单循环血管，发生血栓后无法通过侧支循环进行血液循环，鼠尾组织将逐渐缺血，造成组织坏死[11]。因此，本研究采用角叉菜胶建立小鼠尾血栓，观察植物乳杆菌KSFY04（Lactobacillus plantarumKSFY04，LP-KSFY04）对血栓形成的减轻作用。LP-KSFY04是本团队从新疆喀什地区维吾尔族家庭自产自然发酵酸乳中分离鉴定出的一株乳酸菌，本实验通过动物模型研究LP-KSFY04通过NF-κB通路调节炎症减轻血栓形成的作用，以抗血栓药物双嘧达莫作为阳性对照，比较评价LP-KSFY04对心脑血管疾病和组织器官损伤的潜在功能性作用，以期为LP-KSFY04作为益生菌的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

LP-KSFY04分离鉴定于新疆喀什地区维吾尔族家庭自产自然发酵酸牛乳，菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，专利保藏号为CGMCC No. 15657。

SPF级6 周龄雄性昆明小鼠，体质量（23±2）g，购于重庆医科大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（渝）2018-0003。本研究中动物实验经重庆市功能性食品协同创新中动物实验伦理委员会批准，批准号：2021050005B。

双嘧达莫 亚宝药业集团股份有限公司；肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-6和IL-1β检测试剂盒 上海酶联生物科技有限公司；TRIzol试剂 美国Invitrogen公司；SYBR Green PCR Master Mix、定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）引物美国Thermo Fisher Scientific公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

PUN-2048A半自动血凝仪 北京普朗有限公司；BX43显微镜 日本奥林巴斯公司；Varioskan LUX多功能酶标仪、StoponePlus定量PCR仪 美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 动物实验

小鼠饲养在温度（20±1）℃、相对湿度30%～40%环境下，自由采食和饮水，适应性喂养7 d。50 只昆明小鼠随机分为5 组，每组10 只，分别为正常组、模型组、药物阳性对照组、LP-KSFY04低剂量处理（LP-KSFY04-L）组和LP-KSFY04高剂量处理（LP-KSFY04-H）组。正常组小鼠按0.01 mL/（gmb·d）腹腔注射生理盐水，其余各组小鼠按照0.01 mL/（gmb·d）腹腔注射质量分数0.2%的角叉菜胶溶液[12]；同时，药物阳性对照组小鼠按20 mg/（kgmb·d）灌胃双嘧达莫溶液，LP-KSFY04-L组和LP-KSFY04-H组小鼠按108CFU/（kgmb·d）和 109CFU/（kgmb·d）的剂量灌胃LP-KSFY04菌悬液，持续10 d。灌胃结束后小鼠断颈处死，记录各组小鼠尾部黑尾（血栓）长度，同时心脏取血和取内脏待测。

1.3.2 凝血指标检测

将收集到的小鼠心脏血液采用半自动血凝仪测定活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶时间（thrombin time，TT）、纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）水平和凝血酶原时间（prothrombin time，PT）。

1.3.3 血清和组织炎症细胞因子水平测定

将收集到的小鼠心脏血液在1 500 r/min、4 ℃离心10 min，取上层血清待用。同时称取0.1 g肾脏和肝脏组织分别加入0.9 mL生理盐水，4 000 r/min、4 ℃均质10 min，离心后收集上清液待用。按检测试剂盒说明书方法测定血清和组织中TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

1.3.4 组织病理学变化观察

解剖小鼠后，将小鼠肾脏、肝脏和尾部组织用10%福尔马林溶液固定。脱水48 h后将组织样品包埋在石蜡中，切片，并用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，用光学显微镜观察组织病理学变化[13]。

1.3.5 小鼠尾静脉组织炎症及血栓形成相关细胞因子mRNA表达水平检测

称取0.1 g小鼠尾静脉组织，加入0.9 mL生理盐水，匀浆，再加入1.0 mL RNAzol提取小鼠尾静脉组织RNA，使用超微分光光度法在260 nm和280 nm波长处测定吸光度，计算RNA纯度和浓度，调整RNA质量浓度为1 μg/μL。然后通过反转录生成cDNA后，配制含1 μL cDNA的反应体系，其余试剂包括SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、无菌蒸馏水7 μL和上、下游引物各1 μL。qPCR扩增反应条件：95 ℃、60 s，95 ℃、15 s，40个循环；55 ℃、30 s，72 ℃、35 s，95 ℃、30 s，55 ℃、35 s。选择GAPDH作为内参，按2-ΔΔCt法计算NF-κB p65、IL-6、TNF-α、细胞间黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule 1，ICAM-1）、血管细胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）和选择素E（E-selectin）基因相对表达量[14]。引物序列如表1所示。

表1 本实验中使用的引物序列Table 1 Primer sequences used in this experiment

1.3.6 小鼠粪便中微生物mRNA表达的测定

称取1.0 g小鼠粪便，根据1.3.5节方法测定小鼠粪便中厚壁菌门、拟杆菌门、乳酸杆菌属和双歧杆菌属细菌的mRNA表达水平，将小鼠粪便中总菌的mRNA表达水平设定为1，分析小鼠粪便中以上几类微生物的丰度[15]。

1.4 数据统计与分析

所有实验进行3 次平行测定，结果以平均值±标准差表示。同时采用单因素方差分析进行差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 LP-KSFY04对血栓小鼠黑尾长度的影响

如图1A所示，除正常组，腹腔注射角叉菜胶后各组小鼠尾尖处出现黑尾，即出现尾血栓。如图1B所示，模型组小鼠黑尾长度最长，为（8.43±0.52）cm，显著长于其余各组（P＜0.05）。LP-KSFY04-H组和双嘧达莫组小鼠黑尾长度分别为（3.02±0.44）cm和（2.35±0.47）cm，二者无显著差异（P＞0.05），均显著短于较LP-KSFY04-L组（（5.89±0.58）cm）和模型组（P＜0.05）。

图1 LP-KSFY04对血栓小鼠黑尾长度的影响Fig. 1 Effect of LP-KSFY04 on the length of black tail in thrombus mice

2.2 LP-KSFY04对血栓小鼠凝血4 项指标的影响

如图2所示，与正常组相比，模型组血栓小鼠的APTT显著缩短，TT、PT和FIB质量浓度分别显著延长和升高（P＜0.05）；LP-KSFY04-H组APTT（（129.6±5.5）s）显著长于LP-KSFY04-L组和模型组，但显著短于正常组（P＜0.05）；LP-KSFY04-H组TT（（85.9±5.0）s）、FIB质量浓度（（65.7±4.4）g/L）和PT（（11.2±1.0）s）分别显著短于和低于LP-KSFY04-L组（P＜0.05）和模型组，但显著高于正常组（P＜0.05）。LP-KSFY04-H组APTT、TT、FIB质量浓度和PT均与双嘧达莫组接近，且无显著差异（P＞0.05）。

图2 LP-KSFY04对血栓小鼠凝血4 项指标的影响Fig. 2 Effect of LP-KSFY04 on four blood coagulation indexes in mice with thrombosis

2.3 LP-KSFY04对血栓小鼠炎症细胞因子水平的影响

如图3～5所示，与正常组相比，模型组小鼠血清、肾组织和肝组织的TNF-α、IL-6和IL-1β水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，双嘧达莫、LP-KSFY04-H和LP-KSFY04-L组小鼠血清、肾组织和肝组织的TNF-α、IL-6和IL-1β水平均显著降低（P＜0.05）。其中LP-KSFY04-H组TNF-α、IL-6和IL-1β水平与药物双嘧达莫组之间无显著差异（P＞0.05）。

图3 LP-KSFY04对血栓小鼠血清TNF-α（A）、IL-6（B）和IL-1β水平（C）的影响Fig. 3 Effect of LP-KSFY04 on serum levels of TNF-α (A), IL-6 (B)and IL-1β (C) in mice with thrombosis

图4 LP-KSFY04对血栓小鼠肾组织TNF-α（A）、IL-6（B）和IL-1β水平（C）的影响Fig. 4 Effect of LP-KSFY04 on the levels of TNF-α (A), IL-6 (B) and IL-1β (C) in renal tissue of mice with thrombosis

图5 LP-KSFY04对血栓小鼠肝组织TNF-α（A）、IL-6（B）和IL-1β水平（C）的影响Fig. 5 Effect of LP-KSFY04 on the levels of TNF-α (A), IL-6 (B) and IL-1β (C) in liver tissue of mice with thrombosis

图6 小鼠尾部（A）、肾脏（B）和肝脏（C）组织的HE染色切片Fig. 6 HE stained sections of tail (A), kidney (B) and liver (C) tissues of mice

2.4 LP-KSFY04对血栓小鼠尾组织、肾脏组织和肝脏组织病理学变化的影响

如图6A所示，正常组小鼠尾静脉血管形态完整且圆润、血管壁形态光滑，模型组小鼠尾静脉血管壁中有明显的炎性渗出且出现白细胞浸润，同时血管周围有出血情况，血管内有血栓形成。LP-KSFY04和双嘧达莫均能够减轻小鼠尾静脉血管的病变，且LP-KSFY04-H和双嘧达莫的效果接近，均优于LP-KSFY04-L。对肾脏组织观察也发现模型组小鼠肾脏组织出现病变，肾小球形态不规则，部分甚至出现破裂，组织间炎症细胞浸润现象严重；正常组小鼠肾脏组织和细胞完整，LP-KSFY04-H和双嘧达莫都能够减轻血栓造成的肾组织炎性病变，使肾脏组织形态接近正常组；同时LP-KSFY04-L也能一定程度减轻血栓小鼠肾组织的病变（图6B）。如图6C所示，正常组小鼠肝脏组织完好、细胞大小均匀、中央静脉圆润、肝小叶和肝细胞结构完整、细胞边界清晰；模型组小鼠肝组织中央静脉形状不规则，出现大量炎性细胞浸润，肝细胞边界出现混乱，部分肝细胞的细胞核破裂；LP-KSFY04-H和双嘧达莫能显著抑制血栓造成的肝细胞损伤，两者效果接近，均优于LP-KSFY04-L。

2.5 LP-KSFY04对血栓小鼠尾静脉组织中炎症及血栓形成相关因子mRNA表达的影响

如图7所示，与正常组相比，模型组小鼠尾静脉组织的NF-κB p65、ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、IL-6和TNF-αmRNA表达水平显著升高（P＜0.05）。与模型组相比，LP-KSFY04能够显著下调血栓小鼠尾静脉组织中NF-κB p65、ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、IL-6和TNF-α表达，且LP-KSFY04-H效果更好，与双嘧达莫组无显著差异（P＞0.05）。

图7 LP-KSFY04对血栓小鼠尾静脉组织中炎症及血栓形成相关因子mRNA表达的影响Fig. 7 Effect of LP-KSFY04 on mRNA expression of cytokines related to inflammation and thrombosis in tail vein of mice with thrombosis

2.6 LP-KSFY04对血栓小鼠粪便中微生物水平的影响

如图8所示，正常组小鼠粪便中的厚壁菌门微生物的mRNA相对表达水平（即相对丰度）显著低于其他各组（P＜0.05），而拟杆菌门、乳酸杆菌属和双歧杆菌属的mRNA相对表达水平显著高于其他各组（P＜0.05）。LP-KSFY04能够使模型组血栓小鼠粪便中的厚壁菌门相对表达水平降低，拟杆菌门、乳酸杆菌属和双歧杆菌属的相对表达水平增强，且LP-KSFY04-H和双嘧达莫效果相似。此外，LP-KSFY04-H组的乳酸杆菌属相对表达水平显著高于正常组（P＜0.05）。

图8 LP-KSFY04对血栓小鼠粪便中的厚壁菌门（A）、拟杆菌门（B）、乳酸杆菌属（C）和双歧杆菌属（D）mRNA相对表达的影响Fig. 8 Effect of LP-KSFY04 on relative abundance of Firmicutes (A),Bacteroidetes (B), Lactobacillus (C), and Bifidobacteria (D) in feces of mice with thrombosis

3 讨 论

角叉菜胶可在实验小鼠尾部形成与机体全身炎症关联的血栓，导致小鼠尾部出现混合性血栓充填，进而引起小鼠尾部发生组织缺血性坏死，能肉眼可见血栓引起的小鼠黑尾。因此，小鼠黑尾长度是直观判断实验性血栓程度的一项重要指标[16]。本研究也证明了角叉菜胶可导致小鼠尾部血栓，形成明显黑尾，LP-KSFY04能够缩短血栓小鼠黑尾长度，且高剂量LP-KSFY04效果更优，能达到与抗血栓药物双嘧达莫同样的效果。

凝血4 项（PT、APTT、TT、FIB）是临床检测凝血系统异常的常规方法，能够较为准确地检测出血液性疾病[17]。血栓形成过程中大量消耗凝血因子，致使PT延长，而凝血因子的大幅度缺失又会造成APTT缩短；同时凝血酶发挥作用可以使FIB持续转化为血栓主要成分纤维蛋白，这个过程将导致血液长期保持在高凝状态下，一旦血液纤维蛋白含量异常，机体纤溶增强，同时纤维蛋白降解产物也会增多，从而使TT延长[18-21]。本研究中双嘧达莫和LP-KSFY04能够调控凝血4 项指标，表明双嘧达莫和LP-KSFY04具有抑制血栓形成的作用。

肾脏是机体的重要排毒器官，肾脏出现病变后，机体中各类毒素就难以排出体外，长时间在体内积累，对人体危害极大。机体出现血栓后肾脏代谢受到影响，进而肾脏排毒功能也会受损，严重的情况下由于持续加强的炎症反应还会导致肾衰竭等恶性病变[22]。肝脏负责产生机体内几乎所有凝血因子，在人体凝血和抗凝动态平衡中发挥至关重要的调节作用，肝功能被破坏后往往伴随着血液促凝与抗凝的失衡，因此血栓的形成与肝脏密切相关[23]。本研究通过病理学观察也发现小鼠尾部发生血栓后，肾脏和肝脏组织也出现炎性病变，再次证明了小鼠的尾血栓会累及肾脏和肝脏发生病变，而药物双嘧达莫和LP-KSFY04均能够有效缓解这些病变，且高剂量LP-KSFY04与双嘧达莫作用相当。

炎症与血栓之间具有相互促进的关系，炎症与血栓的持续加剧会导致更为严重的器官损伤，进而危及生命[20]。机体出现炎症后通过Toll样受体导致单核-巨噬细胞、淋巴细胞、内皮细胞等被激活，从而生产大量炎症因子，如TNF-α、IL-6[24]。TNF-α是机体免疫-炎症信号通路中的重要因子，也是血栓与炎症之间的重要介质。TNF-α是细胞中炎症反应的重要始动因子，NF-κB、丝裂原活化蛋白激酶等信号通路均受到TNF-α受体调节，从而大量释放IL-6、IL-β等炎症细胞因子；同时这些炎症细胞因子又再次加强巨噬细胞和淋巴细胞活化，使血管内皮细胞的损伤加重，直接或间接促使血栓的形成[25-26]。特别是，IL-1β通过TNF-α调节从内皮细胞中大量释放，并在血管内皮细胞损伤和血小板聚集过程中发挥关键作用，是导致血栓的重要因子[27]。NF-κB、TNF-α和IL-1β等炎症细胞因子还能使血管内皮细胞中的血栓调节蛋白表达降低，促使血液抗凝活性降低，增加血栓风险；同时还可以增强血管收缩相关因子表达，从而通过血管的持续收缩引发血栓[28]。因此，控制体内NF-κB、TNF-α和IL-1β细胞因子的水平，一方面能够控制机体炎症程度；另一方面也能调节血栓相关因子的表达，从而起到干预血栓形成的作用。在本研究中药物双嘧达莫和LP-KSFY04均对以上炎症细胞因子起到了干预作用，因此具有血栓形成抑制作用。

研究显示NF-κB是血栓形成过程中炎症相关机制的关键调节因子，NF-κB能够在内皮细胞、血小板、炎症反应中起到促进和调节作用，NF-κB通过这些调节作用使机体中的凝血-纤溶状态失衡，导致血栓的形成[29]。ICAM-1在细胞之间和细胞与基质之间的黏附具有明显的调节作用[30]。VCAM-1对血小板的黏附聚集具有调节作用，过度表达会加剧血栓部位的炎症[31]。E-selectin对内皮细胞的炎症损伤和通透性具有调控作用，还可以控制流动血液中总的白细胞与血管内皮细胞的黏附[32]。NF-κB在炎症刺激状态下可以促进ICAM-1、VCAM-1和E-selectin等黏附因子表达加强，进一步放大血栓危害和加剧血栓[33]。本研究中血栓导致小鼠尾部出现炎症反应，以NF-κB通路为中心，ICAM-1、VCAM-1和E-selectin表达水平均较正常状态显著升高。双嘧达莫和LP-KSFY04均能发挥调控NF-κB、ICAM-1、VCAM-1和E-selectin表达的作用，表明LP-KSFY04可能具有良好的血栓形成抑制作用。

血栓形成是心脑血管疾病的重要促因，在机体出现病变后，肠道菌群细胞壁中的有害成分进入血液循环后诱发内毒素血症，造成机体慢性炎症，此过程是血栓发病机制中的重要一环。肠道菌群失调也会导致机体出现炎症，炎症进一步导致血液中凝血因子异常增加，原有的纤溶酶原不足以抵抗凝血因子异常增加造成凝血和溶栓失调，使血栓形成的风险大大增加[34]。人体肠道内绝大部分细菌由厚壁菌门和拟杆菌门微生物组成，厚壁菌门与拟杆菌门丰度的比值与血液黏稠度密切相关，厚壁菌门丰度的增加可能会导致血栓形成[35]。乳酸菌和双歧杆菌已被证实具有多种保健作用，对机体的正常代谢具有积极作用，能够缓解炎症造成的体内毒素积累和血液流动速度缓慢，从而降低血栓形成的风险[36]。另外健康的肠道菌群可通过调节血小板功能及改变凝血功能等多种机制来降低血栓风险[37]。本研究也证实LP-KSFY04能够增加血栓小鼠肠道中拟杆菌门、乳酸杆菌属和双歧杆菌属丰度，同时减少厚壁菌门丰度，从而通过调控肠道微生物，抑制机体炎症，促进血液流通正常，发挥抗血栓作用。

双嘧达莫的副作用包括头痛、眩晕、恶心、呕吐、腹泻等不良反应，而LP-KSFY04作为食品中分离出的乳酸菌，无副作用，具有更好的应用前景。从韩国泡菜中分离出的短乳杆菌J-38被证实具有体外抑制血小板聚集的作用，具有潜在的抗血栓作用[38]。此外，肥胖也是血栓形成的诱因之一，有研究证实从四川泡菜中分离出的发酵乳杆菌CQPC05具有良好的减脂减肥效果，通过减脂减肥也能一定程度降低血栓形成的风险[39]。但是现有研究还缺乏体内实验来准确验证益生菌对血栓形成的干预作用，本研究通过动物实验研究植物乳杆菌LP-KSFY04对小鼠血栓形成的抑制作用。实验结果显示，LP-KSFY04能够有效降低血栓小鼠的黑尾程度和改善凝血4 项指标，一方面通过调控血清、肾脏和肝脏组织中的炎症细胞因子，发挥抑炎作用；另一方面，通过调控NF-κB通路ICAM-1、VCAM-1和E-selectin等黏附因子表达，减轻血栓程度。同时，本研究结果进一步表明LP-KSFY04还通过改善小鼠肠道微生物健康，从而降低炎症程度，发挥血栓形成抑制作用。综上，LP-KSFY04具有较好的实验性抗血栓作用，但目前缺乏临床试验的结果，还需要加强研究。