Numb基因及其可变剪接在胰腺癌中的研究进展

李鹏昊，郑楷炼，许熊飞，金 钢

海军军医大学长海医院肝胆胰脾外科，上海 200433

胰腺癌是预后极差的消化系统恶性肿瘤。虽然近年来胰腺癌的诊断方法、治疗手段与管理理念的不断进步使得患者预后获得较大改善，但其5年总体生存率仍不足10%，依然为“癌中之王”［1］。到目前为止根治性切除仍是胰腺癌最有效的治疗手段，但是超过50%的胰腺癌患者确诊时已出现明显的远处转移［2］，丧失手术根治机会。胰腺癌预后差的主要原因在于胰腺癌细胞具有极易局部侵袭和远处转移的生物学特性，癌症相关基因的可变剪接在胰腺癌侵袭转移中可能发挥重要作用。Numb是一个进化上保守的基因，具有控制细胞不对称分裂和决定细胞命运，调控细胞黏附与迁移、特定底物泛素化及多种信号通路等功能［3］，其复杂的生物学特性在胰腺癌中的作用日渐受到关注。Numb基因可发挥抑癌或促癌作用，产生这种功能差异的原因可能与可变剪接有关，然而Numb基因可变剪接的调节机制仍不完全清楚，所产生的剪接异构体在胰腺癌中的功能有待于进一步揭示。本文将对Numb基因及其剪接异构体的功能特点，及其对胰腺癌的影响进行系统综述。

1 Numb基因及其可变剪接的研究

Numb是近20年来逐渐被认识的一类胞浆蛋白，而后发现，Numb与肿瘤发生、发展密切相关。在不同的肿瘤组织中，Numb表现出的抑癌/促癌作用也不同。在一些肿瘤中Numb高表达促进癌细胞生长。例如，在肺鳞癌中，高水平Numb可促进肿瘤细胞增殖和侵袭［4］；在肝癌中，肿瘤组织Numb水平显著高于周围正常组织且与不良预后相关［5］。而在乳腺癌中，Numb处于缺失状态，Numb表达越低乳腺癌的恶性程度越高，其预后越差［6］。Numb也参与胰腺癌的发生发展及转归，胰腺癌组织标本中Numb的表达水平与肿瘤大小和肿瘤TNM分级、预后呈负相关，是患者预后情况的独立预测指标［7－8］，提示Numb可能发挥抑癌功能。上述情况或可归咎于各类异构体的结构差异［9］。

在哺乳动物体内，Numb的可变剪接根据其mRNA在磷酸酪氨酸结合（phosphotyrosine－binding，PTB）结构域是否有11个氨基酸的外显子（Ex6）插入及在脯氨酸富集区域（proline rich region，PRR）是否有48个氨基酸的外显子（Ex12）插入，产生4种不同的剪接异构体：Numb1（p72）、Numb2（p66）、Numb3（p71）和Numb4（p65）［10］。在所有异构体中，氨基端均包含PTB结构域，具有结合膜蛋白，参与细胞膜定位，调控胞吞等功能［11］；PRR结构域位于蛋白中间区域，参与胞内信号转导并与细胞增殖与分化密切相关。根据PRR结构域中是否含有Ex12插入，Numb蛋白可分为PRRL（p72/p71）及PRRS（p66/p65）两类。在正常的胰腺组织中PRRS的表达量远高于PRRL，其Notch通路活性被抑制；而在胰腺癌组织中PRRL表达上调，PRRL/PRRS的比率明显增高导致Notch1和Notch4的异常激活［7］；在肝癌中，Numb上调同样以PRRL为主，高表达的PRRL表现出明显的促增殖作用［5］。上述研究表明Numb的功能差异可能与剪接异构体类型相关，在肿瘤发生、发展中发挥重要作用。

2 胰腺癌中Numb剪接异构体对不同信号通路的影响

与其他实体肿瘤相比，胰腺癌微环境中含有大量的基质细胞和细胞外基质［12］，肿瘤细胞的分子生物学特征也更为复杂。Numb作为重要的抑癌/促癌分子在其他实体瘤中研究较为广泛。然而，受限于胰腺癌复杂的分子机制和高度异质性，目前Numb在胰腺癌中的研究相对较少，其剪接异构体的不同功能与胰腺癌相关信号通路的关系更是鲜为人知。故Numb亚型和信号通路二者之间的关系值得进一步探讨和研究，为确认胰腺癌治疗的潜在靶分子提供理论基础。

2.1 胰腺癌中Numb剪接异构体对Notch信号通路的影响 人类Notch途径是一种进化上保守的信号转导级联反应，介导细胞增殖与凋亡、多能祖细胞分化等重要功能，从而调节组织、器官的分化和发育［13］。近年来，Numb蛋白对Notch信号通路的调控在胰腺癌中的生物学效应愈发受到重视。研究发现，Numb蛋白能够多层面抑制Notch通路：Numb可以与AP－2结合抑制Notch膜蛋白的转运和内吞［14－15］；Numb蛋白可以抑制Notch胞内结构域（Notch intracellular domain，NICD）共转录因子进入细胞核［16］；Numb蛋白可以直接与NICD结合引起NICD泛素化［17］。剪接异构体的变化也会影响其在Notch通路中的作用，PRRL表达增加激活Notch途径，而PRRS抑制Notch活化及其下游基因的表达，表明Ex12的插入或缺失对Numb功能有重要影响［18］。

与其他实体肿瘤类似，Notch途径在胰腺癌中高度失调，诱导肿瘤细胞放射抵抗与化学耐药、肿瘤干细胞增殖、上皮间质转化（epithelial－mesenchymal transition，EMT）等恶性生物学行为［19－20］。胰腺癌干细胞（pancreatic carcinoma stem cell，PaCSC）作为肿瘤微环境中的重要细胞亚群，其对称分裂特性是导致肿瘤快速增殖、转移、复发与耐药的关键元凶［21－22］。研究［23］证实Notch1异常高表达在对称分裂的PaCSC中普遍存在，使用槲皮素诱导提高胞内miR－200b－3p水平，降低Notch1/Numb比率可有效抑制PaCSC自我更新与增殖，促进其向成骨细胞、软骨细胞与脂肪细胞分化，有效改善肿瘤组织的恶性生物学行为。EMT是指细胞失去部分上皮特性并获得间充质特性的生物学过程［24］。在肿瘤组织中，肿瘤组织微环境变化（例如低氧）以及间质细胞释放的各种细胞外信号和生长因子（例如TGFβ、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子等）作用于肿瘤细胞并促进EMT诱导转录因子的表达，进而降低上皮相关标志（如E－Cadherin、上皮细胞黏附分子和cytokeratin等）蛋白表达而增加间质相关标志（如NCadherin、vimentin和fibronectin等）蛋白表达，启动EMT［25］。大约80%的胰腺癌患者在初次诊断或术后复查时确诊为转移癌，EMT被证实为启动和促进胰腺癌侵袭和转移的关键动力［26］。开发靶向EMT的治疗手段或是缓解胰腺癌患者体内肿瘤转移与化学耐药，改善预后的可行方案［27］。胰腺癌细胞中Numb表达与E－Cadherin呈正相关，与vimentin呈负相关，Numb和ECadherin共表达的胰腺癌患者预后更好，表明Numb可能参与胰腺癌EMT进程［28］。PRRL参与TGFβ1与表皮生长因子诱导的EMT，促进肿瘤细胞体外EMT样形态变化、迁移和侵袭，提高皮下成瘤和肝转移能力。不仅如此，在TGFβ1诱导的肿瘤细胞中还观察到Notch1的NICD水平升高，使用Notch1抑制剂能够显著逆转TGFβ1诱导的EMT，提示PRRL与Notch协同促进胰腺癌细胞EMT［29］。综上，Numb剪接异构体是胰腺癌中Notch信号通路的重要调控因素。

2.2 胰腺癌中Numb剪接异构体对p53的影响 p53是一种应激传感器，在细胞面对各种刺激如DNA损伤、癌基因激活、氧化应激和营养不良时被激活，被认为是最重要的肿瘤抑制因子［30］。野生型p53可通过阻滞细胞周期、促进凋亡等多种方式抑制肿瘤产生，而突变型p53却能避免肿瘤死亡，具有强烈的致癌蛋白特性［31－32］。Numb通过与p53和Mdm2形成三聚体复合物，并与这两种蛋白直接相互作用，抑制Mdm2介导的p53泛素化，从而稳定p53水平，发挥抑癌作用［33］。敲除Numb导致细胞内p53水平与活性降低，继发正常成熟上皮组织分化障碍、EMT、细胞干性重新获得等形态学改变，为肿瘤发生提供重要条件［33］。Numb参与的p53调节过程与剪接异构体关系密切，其泛素化抑制作用主要由PTB介导［34］。免疫共沉淀实验中可观察到Numb－Mdm2或PTB－Mdm2二元复合物，表明Numb或PTB片段能够独立于p53与Mdm2相互作用。而Ex6的编码片段对于这一结合过程至关重要，沉默全部Numb亚型或p72/p66可降低p53水平，沉默p71/p65则没有显著影响［35］。胰腺癌中p53与Numb的关系也被相继证实。相比于p53突变体，胰腺癌细胞中野生型p53受Numb影响更大，过表达Numb显著提高野生型而不是突变型p53水平，siRNA敲低Numb使野生型p53泛素化增强，细胞侵袭能力得到显著提升［8］。综上，Numb影响胰腺癌细胞中p53蛋白调节过程，不同亚型与胰腺癌p53蛋白的关系值得深究。

3 Numb及剪接异构体对胰腺癌治疗的潜在影响

尽管胰腺癌新辅助治疗与免疫疗法的联合使用使患者生存率进一步提高［36－37］，其特殊肿瘤微环境引起的耐药仍是临床治疗的最大阻碍［38］。吉西他滨作为胰腺癌患者化疗一线用药之一，其耐药性是导致患者预后不良的重要原因［39］。相比Numb表达正常的胰腺癌细胞，Numb低表达的胰腺癌细胞对吉西他滨的耐药性显著增强，这可能与野生型p53及凋亡相关蛋白caspase－3含量降低有关［40］，然而具体的分子机制尚不清楚。作为肿瘤治疗的重要疗法，放射治疗在胰腺癌患者中的客观反应率普遍低下［41］。高血糖记忆是糖尿病患者在严格血糖控制条件下由并发症引起的功能失调［42］，被证明是胰腺癌患者放射抵抗的因素之一［43］。Numb在慢性高糖条件下的显著下调与Notch途径的异常激活在放射抵抗形成过程中起到关键作用，过表达Numb或使用二甲双胍则能显著逆转这一过程，通过抑制Notch途径提高高血糖记忆下胰腺癌的放射敏感性［43］。综上，Numb基因参与胰腺癌细胞放射抵抗与化学耐药的复杂过程，深入研究Numb及剪接异构体在胰腺癌中的具体功能，有利于解释胰腺癌耐药机理和提高治疗效果。

4 总结

综上所述，Numb是一个重要的细胞命运决定因子，产生的多种剪接异构体通过Notch、p53等信号通路在胰腺癌细胞增殖与分化、肿瘤侵袭与转移和耐药性等方面发挥不同功能，促进或抑制肿瘤进展。上文提到的干预环节和潜在治疗靶点绝大多数处于前瞻性实验阶段，距离开展临床实验还有很长一段路要走。在晚期胰腺癌治疗十分困难的前提下，迫切需要基于现有理论开发新的治疗方法以改善胰腺癌治疗现状。因此深入了解Numb基因及剪接异构体功能并阐明其在胰腺癌中的作用具有重要意义，为改善胰腺癌的治疗及患者预后提供新的理论和思路。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：李鹏昊负责拟定写作思路，检索文献和论文撰写；许熊飞、金钢、郑楷炼负责课题设计；郑楷炼负责指导、修改论文并最终定稿。