梅花鹿育种技术研究进展与展望

周雅，张禾垟，郑军军，刘琳玲，李浩东，王桂武

（中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112）

梅花鹿鹿茸具有很高的药用价值，在医疗保健方面已得到广泛应用。鹿肉高蛋白、低脂肪，营养丰富，能满足消费者对健康饮食的期望。随着生活水平的提高，人们越来越重视健康，而梅花鹿副产品能够很好地契合健康的主题。2020年，梅花鹿被列为特种畜禽，可以说梅花鹿养殖产业具有广阔的前景[1]。动物生产离不开遗传育种，随着数量遗传学等理论和现代生物技术的发展，育种技术发生了翻天覆地的变化。畜禽育种已从群体层面逐渐转为分子层面，分子标记辅助选择（marker assisted selection,MAS）和基因组选择（genomic selection,GS）等育种技术在畜禽遗传改良中发挥着巨大作用，极大推动了畜牧业的发展[2]。同时，基因编辑等先进育种方式也逐步展开研究，为育种技术的快速发展提供了新的方向。现阶段梅花鹿育种主要通过表型选择（主要是茸重）取得了一定的成果，但存在育种周期长和效率低等缺点。本文总结了梅花鹿育种技术的研究进展，进一步结合先进动物育种技术，旨在为梅花鹿育种技术的发展方向提供借鉴与参考。

1 育种技术

1.1 常规育种技术

在我国近几十年的梅花鹿育种研究中，主要采用纯种选育和杂交育种等手段，以提高鹿茸的产量为目标，对低产梅花鹿进行遗传改良。从1980年西丰梅花鹿的平均单产（干重）0.74 kg到现如今（鲜重与鲜干重比例为3：1）10 kg的鹿茸屡见不鲜[3]，甚至在第十一届（2020年）中国鹿业发展大会暨第八届中国（西丰）鹿文化节的鹿产品展览上出现了（鲜重）27.5 kg的超大鹿茸（疑似花马杂交），可以说遗传育种功不可没，也进一步说明鹿茸产量有着极大的发展潜力。

1.1.1 纯种选育 纯种选育是指在一个品种或种群内，按照加性遗传效应进行选种，并在种畜间进行有计划的选配，以求在下一世代中提高加性有利基因在群体中的频率[4]。双阳梅花鹿的纯种选育于1963年开展，是以双阳型梅花鹿为基础，采用大群闭锁繁育的方法，经过23年的培育，于1986年通过农业部的品种鉴定，是我国第一个梅花鹿品种，品种形成时鹿只数为3 725只，后引种至全国各地[5]。1985年实测上锯公鹿成品茸平均单产（干重）为1.05 kg，比吉林省同期上锯公鹿平均单产657.5 g高59.6%，比黑龙江省农垦系统的梅花鹿公鹿平均单产455.0 g提高130%，并且引种的鹿场进行纯繁和杂交均收到了明显效果，其类型间的杂交后代鹿茸平均单产提高25%～35%[6]。双阳梅花鹿品种培育的成功，为后续品种培育奠定了基础。目前，我国共培育出双阳梅花鹿、西丰梅花鹿、敖东梅花鹿、四平梅花鹿、兴凯湖梅花鹿、东丰梅花鹿和东大梅花鹿等7个梅花鹿品种以及1个长白山梅花鹿品系，对改良低产梅花鹿，促进梅花鹿养殖业发展有巨大作用。但纯种选育的育种周期较长，一般都在20年以上，有的甚至30年。原因在于养殖场根据公鹿产茸量进行选择，产量高的公鹿作为种用，生产实践中，公鹿1岁龄以上可产茸，4～5岁龄定产；母鹿生产性能无法通过表型观察，只能通过其所产公鹿的产茸量进行评定。在这种生产模式下，通过表型测定的方法进行选种，存在效率低和准确度不高等问题。在无法确定其高、低产的情况下，也会加大饲养成本。如果能在早期确定鹿只的高、低产，就能将高、低产鹿进行分别饲养，高产鹿以产茸作为经济收益，低产鹿养到适龄作为肉用鹿出售，可进一步降低饲养成本。

1.1.2 杂交育种 杂交育种是指两个或两个以上不同遗传类型（基因型）的物种或品种的杂交所产生的后代称为杂种，其在生产性能、生活力和抗病性等方面比其双亲具有优势。我国开展鹿品种间杂交试验研究已有63年的历史，最早是在1958年吉林省吉林市龙潭山鹿场用本交的方法开展的[7]。随着人工授精技术的成熟，杂交育种的研究大量开展。我国在鹿品种间杂交研究有东北马鹿与东北梅花鹿的杂交、塔里木马鹿与东北梅花鹿的杂交和天山马鹿与东北梅花鹿的杂交等28余种杂交组合方式[8]。其中茸用型以天山马鹿（）与东北梅花鹿（）杂交组合最佳，杂交F1的适应性、抗病力、耐粗饲和生长速度等均强于亲本，并且鹿茸产值年均盈利，比天山马鹿（父本）和东北梅花鹿（母本）高9倍以上[9,10]。而肉用型以东北梅花鹿（）与东北马鹿（）杂交组合最佳，体成熟的杂交F1公鹿的屠宰率和净肉率分别为58.69%和46.80%，远高于成年东北梅花鹿公鹿54.06%的屠宰率和42.98%的净肉率以及成年东北马鹿公鹿53.16%的屠宰率和42.46%的净肉率[11]。研究表明，花·马杂交F1鹿茸具有与梅花鹿鹿茸相似的营养成分[12]。目前，鹿茸的药用价值研究还相当匮乏，其药效还是参照古代中药典籍的记载，无法通过现代技术进行解释，这也导致了目前鹿茸价值鉴定没有唯一的标准，仅通过测量蛋白质、氨基酸、粗脂肪和微量元素等成分的含量，能否确定其药用价值还是未知数。梅花鹿、马鹿等鹿茸也只是大家约定俗成的认为梅花鹿鹿茸比马鹿鹿茸好，而花马杂交鹿茸的介入，又进一步加大了市场管理的难度。由于缺乏品种保护意识、追求高收益及引种不规范等原因，导致部分地区花马杂交日渐增多，纯种梅花鹿数量急剧减少[13]。中国农业科学院特产研究所特种动物遗传资源青年科技创新团队开发了鹿芯壹号梅花鹿种源检测芯片，可用于纯种梅花鹿的精确鉴别，根据基因分型结果判定待检样本中马鹿血源含量占比，能很好地区分纯种梅花鹿与花马杂交梅花鹿，有助于市场管理与后续育种研究[14]。花马杂交鹿在生产性能上与纯种梅花鹿相比有显著提高，这种提高能否稳定遗传给下一代，将是遗传育种下一步需要解决的问题。同时还应做好纯种梅花鹿的保种措施，没有纯种梅花鹿，何谈杂交育种。

1.2 分子育种

自20世纪80年代以来，随着现代分子生物技术和信息技术的发展，动物基因组计划的研究取得了突破性的进展，动物育种技术逐渐从群体水平走向分子水平[15]。分子育种技术通过对基因组的分析，可以从DNA水平识别基因组的遗传变异及其作用机制，从而确定影响表型性状的功能基因或遗传标记，使育种不受年龄、性别、饲养条件以及外界环境等因素的影响，实现早期育种，缩短育种年限，提高育种准确度[16]。MAS和GS等分子育种技术使育种更加科学、准确，已成为畜禽分子育种的主流做法。基因编辑等新型育种技术可以模仿自然突变修饰整个基因组，通过人工修饰基因组序列来实现精准的畜禽育种[17]。

1.2.1 分子标记辅助选择 MAS是利用分子遗传标记对数量性状基因型进行辅助选择，其原理是通过寻找与某些特定数量性状基因座（quantitative trait locus,QTL）紧密连锁的DNA分子标记，从而间接选择目的基因或QTL。该方法可以从分子水平上对目标性状进行选择，能实现早期选种，加快遗传进展，是提高育种选择效率的有效手段之一。

1980年，Botesin等[18]提出了第1代分子标记限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphisms,RFLP），到如今第3代DNA分子标记单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）的广泛应用，MAS为畜禽遗传改良作出了巨大贡献。如雌激素受体（estrogen receptor,ESR）基因是影响猪产仔数的主效基因，通过对ESR基因的选择，显著地提高猪产仔数[19]。Cui等[20]联合利用有机阴离子转运蛋白家族成员1B3（solute carrier organic anion transporter family member 1B3,SLCO1B3）和生长激素受体（growth hormone receptor,GHR）基因的分子标记，成功培育出蓝蛋壳矮化纯系鸡，矮化鸡饲料消耗量低、提高产蛋率，而蓝壳蛋脂肪含量更低，蛋白质、必需氨基酸等含量更高，为培育畜禽新品种提供新的思路。对于由一个或两个主效基因控制的经济性状而言，分子标记辅助选择是最有效的方法。其优势在于不需要筛选参考群体，仅需对目标性状的分子标记进行基因分型，便可挑选出合适的优良个体。然而到目前为止经过验证并应用于畜禽育种中的分子标记数量还相当有限，越来越多的研究表明，大多数经济性状由多基因控制，极大地限制了MAS在畜禽育种中的应用。目前，梅花鹿的分子标记相关研究多关注产茸量，在以往的研究中，梅花鹿雄激素受体（androgen receptor,AR）、褪黑素受体1A（melatonin receptor 1A,MTNR1A）、生长激素（growth hormone,GH）和胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factors-1,IGF-1）等[21,22]基因均存在多态性位点与产茸量相关，可作为选择高产梅花鹿的候选基因。李馨等[23]利用11个微卫星分子标记对120只兴凯湖梅花鹿进行遗传多样性检测，并进行与鲜茸重相关性分析得到5个与鲜茸重性状显著相关的位点，其中BM1225位点BC、CE两基因型与其他基因型有显著差异（P＜0.05），T172位点两纯合型AA基因型鲜茸重显著高于BB基因型（P＜0.05），确定BM1225与T172两个微卫星基因座可以作为兴凯湖梅花鹿鲜茸重性状的分子标记。越来越多的研究表明，梅花鹿产茸性状由多基因控制，必须有对表型性状贡献率较高的位点，才可进行分子标记辅助选择，然而在目前的研究中，产茸量相关分子标记的贡献率相对较低，不适合分子标记辅助选择。除鹿茸相关性状外，梅花鹿在分子标记方面的研究还相对较少，牛、羊、猪和鸡等畜禽经济性状的分子标记研究可为梅花鹿的育种研究提供参考。如肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）基因是产肉性状的重要基因，该基因已在畜禽育种中得到极大关注[24,25]，绵羊多胎（booroola fecundity,FecB）基因（也称为BMPRIB，BMPR1B或ALK-6）是影响羊产仔数的主效基因[26,27]，这两个基因可作为研究梅花鹿产肉性状和产仔性状的参考。通过对梅花鹿茸重、产肉、产仔数和抗病等性状的分子标记进一步研究，MAS技术在梅花鹿育种中的应用有着巨大潜力。

1.2.2 基因组选择 GS通过对参考群体中每个个体的表型性状信息和SNP基因型估计出每个SNP的效应值，然后测定候选群体中每个个体的SNP基因型，计算候选个体的基因组估计育种值（genomic estimated breeding value,GEBV），根据育种值的高低进行选择[28]。简而言之，GS就是MAS在整个基因组上的应用，对于多基因控制的经济性状而言，GS准确度更高，因此，GS在畜禽育种中的应用也更加广泛。

目前，我国在基因组选择工作中已构建了由6 000头母牛和400头验证公牛组成的中国荷斯坦奶牛基因组参考群，对中国所有公牛站的3 031头青年公牛进行遗传评估，结果表明遗传评估准确性在65%～80%，比传统的系谱选择准确性提高12%～25%[28,29]。基因组选择在传统家畜的应用相对广泛，而梅花鹿的生产方式与奶牛极为相似，梅花鹿公鹿产茸，奶牛母牛产奶，母鹿与公牛都无法通过表型测定进行选择，因此通过基因组选择更加准确，并且奶牛的基因组选择研究相对成熟，有很好的借鉴作用。近年来，基因组学发展迅速，测序价格不断降低，使梅花鹿从整个基因组上挖掘相关经济性状的功能基因或分子标记成为可能。2017年，胡鹏飞等[30]首次运用重测序技术对饲养条件基本一致的梅花鹿高、低产各50只进行茸重性状的全基因组关联分析研究，获得94个SNPs与茸重性状显著相关，对于梅花鹿遗传标记研究来说具有划时代意义，但分子标记需要通过验证才能应用到分子育种中，而不仅仅只是推断。2020年，赵佩等[31]利用265只梅花鹿对上述94个SNPs进行基因分型并进行与产茸性状相关性分析，得到7个SNPs与产茸性状显著相关（P＜0.05），通过不同基因型与产茸性状的多重比较，确定3个位点（SNP307_1564879、SNP614_2586055、SNP2027_42481）的优势基因型组合GGAACC型，并经随机抽样验证确定该基因型可作为选择高产梅花鹿的分子标记。同年，Hu等[32]利用341只梅花鹿对31个SNPs进行基因分型，与茸重性状关联分析确定了16个显著相关的SNPs。目前，梅花鹿参考基因组虽已完成，但尚未发表，梅花鹿茸重相关分子标记研究多以牛、羊或者其他鹿种的基因组作为参考，可能存在一些偏差，但这些经过群体验证的SNPs可用于梅花鹿的基因组选择，待梅花鹿基因组发表后，相关性状分子标记研究将进一步深入。尽管从整个基因组挖掘与茸重性状相关的SNPs，这些SNPs大多位于基因间区，可能在鹿茸生长发育过程中起到调控作用，而不是直接影响其生长。Jia等[33]首次通过转录组测序挖掘梅花鹿茸重性状相关的表达序列标签（expressed sequence tag,EST）微卫星，通过验证确定了8个EST微卫星，特别是M009和M027，可作为二杠茸重量性状的分子标记。该方法从转录组方面挖掘梅花鹿茸重性状的分子标记，避免了没有参考基因组的问题，同时所筛选的分子标记全部位于编码区，可能对鹿茸生长发育有重要作用。待梅花鹿基因组发表后，可能从基因组上挖掘相关性状的SNPs和微卫星会成为主流，但现阶段从转录组测序方面挖掘EST微卫星依旧是最经济有效的方法。

现阶段梅花鹿基因组选择还处于起步阶段，经济性状的SNP位点还需进一步挖掘，同时还存在构建核心参考群和使用何种算法模型等问题。核心参考群需要数量足够大、性状优良的梅花鹿群体。吉林省作为养鹿大省，拥有庞大的养殖数量，所养殖东北梅花鹿拥有优良特性，适合构建参考群。迄今为止，基因组最佳线性无偏预测法（genomic best linear unbiased prediction,GBLUP）在基因组选择中广泛应用，与传统BLUP法相比，GBLUP拥有更快的运算速度，大多数情况下预测的准确性更高[34]。除此之外，还有单步法GBLUP（single-step GBLUP,ssGBLUP）、贝叶斯方法（Bayes-A、Bayes-B、Bayes-Lasso和Bayes C等）及机器学习等算法模型。由于缺乏系谱信息，GBLUP法或许更适用于梅花鹿，通过基因组关系矩阵G来代替传统BLUP法中基于系谱信息构建的亲缘关系矩阵A，但由于基因组上大部分标记效应较小，使估计准确性存在一些偏差。贝叶斯方法计算准确性更高，但计算量庞大，还无法实现并行运算，难以满足育种的时效性需求。因此，何种算法模型在梅花鹿育种中更加实用还有待进一步研究。

1.2.3 基因编辑技术 基因编辑技术是通过人工核酸酶对动物受精卵的内源性基因进行修饰，如敲除、插入和定点突变等，再通过胚胎移植技术获得具有优良性状的个体，是动物遗传改良最先进的方法。有利的等位基因很少都出现在一个单独的个体中，与传统选择相比，基因编辑能将自然产生的等位基因从一种动物转移到另一种动物，提供了比传统育种更快地增加个体或品种中理想等位基因频率的机会。

基因编辑有助于改善畜禽生产性能，增强抗病能力，改善各种动物产品品质，并且基因编辑家畜可以作为研究人类或家畜生理和疾病的生物模型，也可以作为生产复杂蛋白质的生物反应器，还可以作为移植的器官捐赠者。Ding等[35]使用CRISPR/Cas9技术敲除绵羊MSTN基因，使MSTN对骨骼肌生长发育的抑制作用消除，提高产肉率。Yang等[36]利用CRISPR/Cas9系统通过体细胞核移植的方法成功生产出CD163基因敲除猪，为预防猪“蓝耳病”提供有效策略。Su等[37]使用TALEN技术将-糖苷酶（LacS）插入到牛基因组中，加入-酪蛋白启动子，使其仅在牛乳腺泌乳时期特异性表达，所产出的牛奶通过简单加热就能水解乳糖，解决部分人群患有乳糖不耐受不能很好利用牛奶中营养的难题。各种基因编辑家畜由于其与人类的生理相容性，在科学和生物医学研究中可以作为有利的动物模型。这些家畜包括牛、羊和猪等，分别用于研究人类女性生殖、肺功能以及各种疾病（包括糖尿病、肌肉营养不良、免疫缺陷和癌症等）[38,39]。基因编辑在畜禽品种改良、动物模型制作、生物反应器及器官移植等多个领域的研发与应用研究广泛，同时为畜禽育种提供新的思路，使畜禽育种不再是从差到优，而是从无到有的转变，可以说基因编辑技术打开了育种研究的新天地。

鹿茸可作为天然的治疗哺乳动物断指断肢医学模型。目前基因编辑在梅花鹿中应用多用于研究鹿茸再生机制，如敲除转化生长因子1(transforming growth factor beta 1,TGF－1)基因导致体外培养鹿茸软骨细胞生长受到抑制[40]，可推测TGF－1基因与鹿茸软骨细胞生长有关，通过相关通路或许能找到控制鹿茸再生的机制，对治疗断指断肢及皮肤再生等医学难题有重要意义。同时，对梅花鹿育种也起到辅助作用，目前还没有发现基因编辑用于梅花鹿育种方面的研究，可以肯定的是基因编辑在梅花鹿育种上存在很大的发展潜力。如提高鹿体抗病能力及母鹿产仔率等方面有较大的研究价值，随着基因编辑技术的不断完善，其在梅花鹿育种中的应用未来可期。

2 展望

随着数量遗传学和基因组学的迅速发展，育种方法发生重大变革，育种从群体层面到分子层面，育种对象从个体到胚胎，育种技术的发展与畜牧业发展相辅相成，随着5G时代的来临，智能畜牧业必将迅速发展，分子育种技术准确、高效，能满足畜牧业发展的需求，将是未来育种技术发展的大方向。梅花鹿被列为特种畜禽后，梅花鹿养殖业越来越受到重视，其育种研究也必须与时俱进。但梅花鹿进入分子育种还有很长的路要走，相关性状分子标记研究还相对较少。梅花鹿是集食用、药用和观赏价值于一体的特种畜禽，其分子标记研究除茸重性状外，还可以关注产肉、抗病及繁殖等性状，从茸用、肉用和作为观赏动物等多方面发展，发挥特种畜禽的优势。全基因组关联分析和转录组测序等方法在研究梅花鹿茸重性状中发挥了重要作用，同时也可为其他性状的研究提供一定的参考。表型数据是梅花鹿经济性状研究的难题，不同于其他动物，梅花鹿很难进行人工保定，一般都需要麻醉，才能测量相关数据，茸重性状可在锯茸时获取，是其最常见也最容易得到的表型数据，这也是导致茸重性状研究较多的原因之一。需进一步加强科企合作，投入摄像机、测量体重的自动秤等设备，从而获取表型数据进行相关分子标记研究。随着各种性状分子标记的挖掘，育种芯片所包含的信息将更加全面。有传统畜禽育种技术研究作为参考，梅花鹿育种技术的发展将更加迅速。在未来，育种将越来越智能化，通过摄像机、红外线扫描等设备测量表型数据，经计算机算法模拟，筛选出最佳配种组合。基因编辑技术还可将其他物种的优良基因进行修饰植入胚胎，再用胚胎分割、胚胎移植等技术获得优良群体，以新技术融合为特征，畜禽育种精准化工厂化时代正扑面而来。