鸡新城疫微量红细胞凝集抑制试验检测结果不确定度评定

张 宁，宋善道，王书丽，李志娟

（1.河南省兽药饲料监察所，河南 郑州 450003；2.河南国康检测技术有限公司）

测量不确定度，简称不确定度，是指根据所用到的信息，表征赋予被测量值分散性的非负参数（JJF 1059.1-2012）或表示与测量结果相关联的参数，表征合理地赋予被测量值的分散性。其结果为表征结果的分散性，根据计算结果，其结果必然为非负数。具体而言，不确定度包括由系统影响引起的若干分量。测量结果包括估计值和测量不确定度，而不确定度反映了测量结果的可信程度。

本研究利用HI 试验测定鸡新城疫病毒（NDV）抗体，并对测量不确定度进行了评定和计算，提供了测量过程中各分量的组成和计算方法，科学评定了此方法的准确性，以期为兽医实验室测量不确定度评估提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品 8份待检鸡血清，均来自河南省兽药饲料监察所，均为留样样品。

1.1.2 试剂 PBS（0.1mol/L，pH 7.0～7.2），自配；1%鸡红细胞悬液，采自河南省兽药饲料监察所饲养的无新城疫SPF 鸡血清配制；新城疫标准抗原，购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司，批号：20210412；新城疫标准阳性对照，购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司，批号：20210412；新城疫标准阴性对照，购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司，批号：20210412。

1.2 主要仪器与设备

电热恒温培养箱（DH-420AB），购自北京中兴伟业世纪仪器有限公司；高速台式冷冻离心机（TGL-16MC），购自湘仪离心机仪器有限公司；移液器（八通道），5～50 μL，购自大龙兴创实验仪器（北京）股份公司；移液器，10～100 μL、100～1 000 μL，购自大龙兴创实验仪器（北京）股份公司。

1.3 试验方法

1.3.1 血凝素工作液配制

血凝素凝集价测定：按照表1，对96孔微量板法布局，用PBS（0.1 mol/L，pH7.0～7.2，下同）将血凝素稀释成不同倍数，加入与抑制试验中血清量等量的PBS，再加入1%鸡红细胞悬液。将96 孔微量板在振摇器上摇匀，置室温20～40 min 或置2～8℃40～60 min，当对照孔中的红细胞呈显著纽扣状时判定结果。以使红细胞完全凝集的最高稀释度作为判定终点。

表1 96孔微量板法测定凝集价 （单位：mL）

1.3.2 血凝素工作液配制及检测

1.3.2.1 四单位HAU血凝素的配制

如果血凝素凝集价测定结果为1：1024（举例），4个血凝单位（即4HAU）=1024/4=256（即1：256）。取PBS 9.0 mL，加血凝素1.0 mL，即成1：10稀释，将1：10稀释液1.0 mL加入24.6 mLPBS中，使最终浓度为1：256。

1.3.2.2 检测

检查4HAU 的血凝价是否准确，应将配制的1：256 稀释液分别以1.0 mL 的量加入PBS 1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 和6.0 mL 中，使最终稀释度为1：2、1：3、1：4、1：5、1：6 和1：7。然后，从每一稀释度中取0.25 mL，再加入1%鸡红细胞悬液0.25 mL，混匀。

如果用微量板，方式相同。即从每一稀释度中取0.025 mL，加入PBS 0.025 mL，再加入1%鸡红细胞悬液0.025 mL，混匀。

将血凝板置室温40 min 或置2～8℃60 min，如果配制的抗原液为4 HAU，则1：4 稀释度将给出凝集终点；如果4 HAU 高于4 个单位，可能1：5 或1：6 为终点；如果较低，可能1：2或1：3为终点。应根据检验结果将血凝素稀释度做适当调整，使工作液确定为4 HAU。

1.3.3 血凝抑制试验（HI）

按照表2，对96孔微量板法布局，PBS将本血清做2倍系列稀释，加入含4 HAU 的血凝素液，并设PBS 和血凝素对照，充分振摇后，置室温下至少20 min 或在2～8℃下至少60 min，再加入1%鸡红细胞悬液，置室温20～40 min 或置2～8℃40～60 min，当对照孔中的红细胞呈显著纽扣状时判定结果。以使红细胞凝集被完全抑制的血清最高稀释度作为判定终点。

表2 96孔微量血凝抑制试验 （单位：mL）

2 结果及分析

2.1 数学模型

式中， Xi—同一血清样本单次检测的新城疫抗体HI效价（log2）；

n—平行样数量；

2.2 测量结果

对8份鸡血清进行HI重复性测定，结果见表3。

表3 8份鸡血清HI重复测定结果表

2.3 不确定度评定

2.3.1 测定方法重复性导致的不确定度ua

对血清样品新城疫HI抗体效价进行8次重复测定，平均HI效价为：

实际标准差为

2.3.2 由测量仪器和测定过程导致的不确定度ub1

测定一个血清样本需采用200 μl 移液枪进行多次操作，其中在96 孔V 型板中加入25 μl PBS 需重复操作10次，血清的稀释需用移液器进行10 次重复操作，添加4 HAU抗原需移液枪进行10次重复操作，添加1%鸡红血球移液枪进行10次重复操作。主要考虑以下分量：200 ul移液枪经检定合格，按照《JJG 646-2006移液器检定规程》吸取25 μl液体，允许最大误差为±1 μl，该量为均匀分布，包含因子k=

移液器重复带来的不确定度ub2，取移液枪，精密量取水200 uL，称重，重复10次，结果见表4。

表4 移液器重复10次检测结果

称重的标准偏差为Sm=0.7559 g，故S移=0.7559 mL。

温度效应引入的不确定度ub3，整个实验过程中环境温度变化2℃，考虑其对体积的影响。

整个过程需进行40 次移液器的重复操作，所以由测量仪器和测定过程导致的不确定度ub。

2.3.3 人员读数导致的不确定度uc

检测人员在观察读数时，因受观察时间、操作经验以及1%红血球溶血度等因素的影响，会产生读数误差。估计该差a=0.1（log2），为均匀分布，包含因子k=

2.4 合成标准不确定度

计算鸡新城疫微量红细胞凝集抑制试验测定的合成标准不确定度。

2.5 扩展不确定度

取包含因子k=2，扩展不确定度U=k×u=0.27×2=0.54≈0.6，新城疫微量红细胞凝集抑制试验HI 效价为（7.0±0.6）log2，（k=2）。

3 讨论

通过对构成不确定度的各分量进行详细分析，并分析各分量在整体不确定度值中所占的比例，可直观了解对检测结果质量影响最大的因素，在对这些因素针对性地改进后，可以有效提高检测质量。

本研究评估结果显示，标准不确定度为0.27，扩展不确定度为0.6，置信水平P=95%，k=2。试验表明，该检测不确定度的主要来源为测定方法重复性、移液器、温度环境、人员读数带来的不确定度。在样品测量值处于阳性判定值附近时，需要考虑不确定度的存在。该方法可有效评定鸡血清中鸡新城疫病毒抗体检测结果的不确定度，可为实验室在今后的血凝抑制试验检测中提供参考。□