非洲猪瘟病毒主要结构蛋白B细胞表位的研究现状

栗 宁，周景明，王爱萍

(郑州大学 生命科学学院，河南郑州 450001)

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是猪的一种烈性病毒病，其临床症状主要有发热、出血、呼吸和神经系统功能紊乱等，病死率可达100%，危害十分严重。1921年，该病首次暴发于非洲肯尼亚，目前该病已经在整个非洲、欧洲、南美洲等多个国家和地区蔓延，对全球养猪业造成了巨大的经济损失。2018年我国报道了首例ASF[1]，之后在全国范围内迅速蔓延，对我国养猪业造成了巨大的打击。在没有有效的疫苗或防控措施的情况下，不得不用扑杀猪来控制疫情的暴发，据报道，在2018年-2019年间有超过3 000万头猪被扑杀，给全球养猪业造成了近20亿美元的经济损失。ASF被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的动物疫病[2]。

ASF的致病病原是非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)。ASFV可感染家猪、野猪、丛林猪等。病猪及隐性带毒野猪是该病的传染源，而软蜱是ASFV的重要传播媒介。ASFV属于非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfarvirus)的唯一成员，是一种巨大且复杂的DNA病毒，其基因组是单股双链线性DNA，长度约180 kb，包含151～167个开放阅读框(open reading frames，ORFs)，病毒粒子为正20面体结构，直径约260 nm。病毒基因组核心的外围包裹着三层膜结构，分别为两侧的脂质膜，以及中间的蛋白衣壳[1,3]。

1 ASFV p72蛋白B细胞表位的研究进展

2019年Wang N等人[4]利用冷冻电镜三维重建技术，首次解析了ASFV的衣壳结构，其衣壳由17 280个蛋白质组成，包括主要衣壳蛋白(p72)和次要衣壳蛋白(M1249L，p17，p49和H240R)，次要的衣壳蛋白在衣壳下方形成复杂的网络，将相邻的衣壳蛋白聚集在一起来稳定衣壳结构。该项工作为ASFV的组装机制及感染机制的研究提供了重要的数据支撑。

ASF是一种高度传染性和致死性的猪病毒性疾病，在没有有效的ASF疫苗的情况下，ASF诊断产品的研发成为了当前的研究热点之一，可靠的实验室诊断和严格的生物安全管控对于该病的预防和控制至关重要。在结构蛋白中，p72、p30和p54被证明具有高度免疫原性及抗性[5]，虽然其产生的中和抗体不足以对机体产生足够的保护，但却可以成为ASF检测和监控的候选靶标。

p72蛋白是ASFV的主要衣壳蛋白，由B646L基因编码，大小约72 ku，据报道p72蛋白具有构象中和表位，它能诱导机体产生中和抗体[5]，是检测试剂及疫苗开发的重要靶标[6]。

Phillips M E等人[7]利用猪多抗血清和抗p72的单克隆抗体(mAb)鉴定出p72的B细胞表位，首先利用原核表达系统制备了p72蛋白N-端1-345 aa的5个重叠多肽。利用间接ELISA和Western blot鉴定了单克隆抗体、猪多抗血清与重叠多肽的反应。利用多抗血清鉴定出2个p72的B细胞表位区域，分别是1-83 aa、250-280 aa；利用抗p72单克隆抗体鉴定出3个p72的B细胞表位区域，分别为100-171 aa、180-250 aa、280-345 aa。最终用寡肽进行精细定位鉴定出6个不同的线性表位，分别为280-289 aa、295-303 aa、160-165 aa、250-255 aa、165-171 aa、275-280 aa。这些表位的精确定位有助于开发检测抗ASFV抗体的ELISA试剂盒。

Rowland等人[8]利用杆状病毒表达了p72蛋白N-端残基20-303 aa，并用该重组蛋白免疫小鼠，通过细胞融合技术制备了29株单克隆抗体，建立了抗p72(N-端残基20-303 aa)单克隆抗体库。并利用ASFV Lisbon感染的Vero细胞，通过间接免疫荧光试验(IFA)对抗体进行了检测。结果显示6种抗体均为IFA阳性(可以与ASFV Lisbon感染的Vero细胞发生反应)，并选择用于进一步表征。利用重叠多肽法进行表位作图，获得p72蛋白的B细胞表位为165-171 aa、265-280 aa、280-294 aa、290-303 aa。所有mAb所识别的位点均位于p72的高度保守的区域内。该抗体组的建立为ASFV检测试剂的开发提供材料基础。

2 ASFV p54蛋白B细胞表位的研究进展

p54蛋白是一个主要感染蛋白，是病毒存活和复制必不可少的成分[9]，其与病毒的吸附作用相关。p54蛋白由E183L基因所编码，大小约为25 ku。该蛋白具有跨膜区，主要位于内质网膜处，该跨膜区在病毒包膜前体的转化过程中具有重要作用[10]。p54蛋白对ASFV在宿主细胞内的运输过程中发挥重要作用。据报道，由大肠埃希氏菌系统和杆状病毒表达的p54重组蛋白可应用于ASFV的血清学的诊断。

在没有有效的ASF疫苗的情况下，诊断工具对于及早发现和实施控制措施至关重要。p54出现在病毒复制早期，是进行ASF检测和监视的具有优势的血清学靶标之一。有研究显示[11]，利用杆状病毒表达了p54截短多肽片段60-178 aa，并用该重组蛋白免疫小鼠，通过细胞融合技术制备了12种单克隆抗体(mAb)。其中5个mAb对ASFV感染的细胞和重组p54蛋白具有阳性反应性。表位作图研究显示，mAb#154-1识别p54蛋白上的保守序列(65-75 aa)；mAb#101和mAb#117识别p54蛋白上的多肽序列(118-127aa)。利用感染低毒OURT 88/3株的猪抗血清，可鉴定出p54的B细胞表位(118-127 aa)。该研究结果确定了位于p54上的重要抗原区域和免疫原性区域，这些区域为ASFV诊断试剂的研究提供了候选靶标。

ASFV单克隆抗体和重组蛋白的研究与制备将有助于抗原的表征与分析，进而有助于新型诊断试剂的研发。有研究团队[12]制备了p54的重组蛋白，并针对该蛋白制备了大量单克隆抗体。该研究建立了一种单克隆杂交瘤细胞株的筛选方法，该方法利用酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接免疫荧光试验(IFA)筛选出能够与被ASFV感染的细胞株反应的单克隆抗体，最终筛选出5株抗p54的单抗，在2种测定中均为阳性。又利用免疫组化(IHC)试验进一步鉴定了上述单克隆抗体与ASFV感染的猪组织的反应性。然后，分别在细菌及哺乳动物细胞中表达了p54的多肽片段，利用筛选的单克隆抗体鉴定了p54的线性B细胞表位(54-113 aa、83-143 aa、113-183 aa、60-75 aa、65-79 aa、113-127 aa、118-132 aa)，同时证明了这些线性表位也可以被ASFV感染猪的多抗血清捕获，并获得了p54的免疫显性区：113-132 aa。该研究结果为ASFV诊断试剂的研究、监测和疫苗开发提供了有效的数据支撑。

3 ASFV p30蛋白B细胞表位的研究进展

在构成ASFV病毒体的结构蛋白中，p30是最具免疫原性的蛋白之一，是在ASFV感染的早期产生的。这两个特征使p30成为检测ASFV感染较为理想的靶标[13]。

p30是ASFV的早期病毒蛋白，由CP204L基因编码，该蛋白的分子质量约为30 ku，经证实该蛋白具有良好的抗原性。通常在ASFV感染细胞后约2 h至4 h观察到蛋白质的表达，然后在整个感染周期中持续表达[14]。研究人员发现重组p30蛋白在通过ELISA检测抗体方面比p54蛋白更有效。有人在体外试验中评估了重组p30、p54和p72蛋白的反应原性，结果表明p30最适合被用作为诊断抗原[15]。有研究表明，针对p30蛋白的抗体可以抑制病毒内化，表明该蛋白在ASFV病毒的入胞过程中起重要作用[5]。

Petrovan V等人[13]制备了p30的重组蛋白，并针对这种蛋白制备了3株单克隆抗体。间接免疫荧光试验结果显示，这些单克隆抗体可识别经BA71 V(基因型Ⅰ)株和Georgia /2007(基因型Ⅱ)株感染的Vero细胞和猪巨噬细胞。又利用免疫组化(IHC)试验进一步鉴定了上述单克隆抗体与ASFV感染的猪组织样本的反应性。分别在细菌及哺乳动物细胞中表达了p30的多肽片段，利用筛选的单克隆抗体鉴定了p30的B细胞表位区域(61-93 aa、120-204 aa)，同时检测了表位多肽与ASFV感染猪的多抗血清的反应性，最终获得了p30的免疫显性区101-150 aa。该研究结果为ASFV诊断试剂的研发提供了有效的数据支撑。

在一项研究中，Wu等人[16]制备了21种针对ASFV p30的单克隆抗体(mAb)，利用这些单抗鉴定了p30的4个表位区域，即84-91 aa、96-105 aa、116-125 aa、146-160 aa，其中，位于p30蛋白C-端的表位能引起宿主抗体有效的体液免疫应答，是免疫优势区域，且其氨基酸序列高度保守。该研究获得的mAb和p30抗原表位，为开发ASF的诊断产品提供了帮助。

4 讨论

非洲猪瘟是猪的一种烈性病毒病，其临床症状主要有发热、出血、呼吸和神经系统功能紊乱等，病死率可达100%，危害十分严重。ASF在世界范围内的肆虐，给全世界的养殖业造成巨大的经济损失。ASF的防控依旧是世界性难题，目前尚无有效的疫苗和药物。病毒表位信息是诊断试剂和疫苗的研发基础。抗原表位是现代分子免疫学、疫苗学的研究热点之一[17]，其是大分子抗原物质的抗原决定簇也是基础作用元件，能与BCR及主要组织相容性复合物(MHC)分子高效结合，从而较为全面地激活机体的适应性免疫应答，从而产生具有一定功能的免疫细胞及抗体。

传染性疾病防控的核心是疫苗，而中和性抗原表位则是疫苗研究的基础。中和性抗原表位是一类功能性B细胞表位，其可以刺激机体产生中和抗体，高滴度的中和抗体可以保护机体免受病原的攻击，因而中和性抗原表位是制备预防性疫苗的重要靶点。然而，研究证明了ASFV p30、p72、p54蛋白可以刺激机体产生特异性中和抗体，但是并不能对机体提供足够的保护[5]，所以，ASF疫苗的制备仍然是世界性难题。ASFV p30、p72、p54重组蛋白用于制备检测产品是一条可行的方案[6-8,11-13,15-16]。表位的研究有助于提高检测试剂的检测效率，同时有助于新型检测试剂的开发。