高产蜜香功能菌株在馥郁香型白酒中的应用研究

冯 亮，郑晓卫，，叶 力，夏 冰，梁宏运，陈晓园，吴新亮，杨 儒，孙玉婷

（1.酒鬼酒股份有限公司，湖南吉首 416000；2.中粮营养健康研究院有限公司，北京 102209）

馥郁香型白酒以五谷为原料，小曲和大曲作为糖化发酵剂，经泥窖固态发酵、清蒸混入、陈酿、勾调而成，具有窖香、曲香、蜜香等复合香气[1]，小曲的主要功效为糖化作用，与传统小曲酒中小曲的功效一致。馥郁香型白酒工艺中使用的小曲，起主要糖化功能的菌株为米根霉，因此小曲也称为根霉曲。据文献报道，酒鬼酒使用的多粮糖化工艺，糖化效果最好，原料的出酒率最高[2]，根霉曲对基酒品质有着十分重要的影响。然而，目前白酒行业使用的根霉曲存在菌株组成复杂、香气不好、糖化力有待提高等问题[3]，阻碍了根霉曲在白酒酿造业的大规模应用和规模化生产。因此，筛选高糖化力、发酵性能良好、典型风味突出的功能菌株，是稳定白酒酿造工艺，提高产品品质主要措施之一。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 样品

原料、麸曲和糖化料，2020 年取自酒鬼酒股份有限公司；商业根霉曲，酒鬼酒股份有限公司提供。

1.1.2 试剂及耗材

孟加拉红琼脂、马铃薯葡萄糖肉汤、马铃薯葡萄糖琼脂培养基均购自于北京奥博星生物技术有限责任公司；真菌DNA 基因组试剂盒购自于美国Omega Bio-Tek 公司；免疫亲和柱购自于美国Romerlabs 公司；四甲基戊醇（纯度为99 %）购自于德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.1.3 培养基的配制

孟加拉红培养基：称取36.6 g 孟加拉红琼脂，煮沸溶解后分装，121 ℃灭菌20 min。

PDB 培养基：称取35 g马铃薯葡萄糖肉汤培养基，煮沸溶解后分装，121 ℃灭菌20 min。

PDA培养基：称取37 g马铃薯葡萄糖琼脂培养基，煮沸溶解后分装，121 ℃灭菌20 min。

基础培养基：酵母浸粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，pH值自然，121 ℃灭菌15 min。

1.1.4 仪器设备

蔡司AxioLab.A1 生物显微镜，卡尔蔡司(上海)管理有限公司；S-4300N 扫描电镜，日本日立公司；NanoDrop One 微量核酸蛋白分析仪，美国Thermo Fisher公司；Agilent 7890B气相色谱仪（配氢火焰离子化检测器）、Agilent 1260 液相色谱（配荧光检测器）、Agilent 8890-5977B 气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent 公司；ME204 分析天平（感量为0.1 mg），梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Milli-Q 纯水仪，美国密理博公司。

1.2 实验方法

1.2.1 功能菌株筛选及鉴定

1.2.1.1 筛选

分别取原料、麸曲、糖化料（糖化时间0 h、5 h、18 h、24 h）粉碎后按照1∶9 溶于45 mL 无菌生理盐水，室温振荡10 min，取上清液逐级稀释制备梯度菌悬液，将各梯度菌悬液涂布于孟加拉红培养基中，28 ℃培养箱中静置培养2～3 d，随机选取具有典型霉菌菌落特征的单菌落，划线分离纯化2～3次，直至平板上的菌落为同一形态，获得单个纯种菌落。

无菌条件下，挑1 环菌丝，接种于PDB 液体培养基中，28 ℃振荡培养3 d 后过滤，参考崔香香等[7]的分析方法，采用顶空固相微萃取-气质联用（solid-phase micro-extraction gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）法检测挥发性风味物质并进行感官评价。将菌株制备成麸曲后对其糖化力进行检测，初步筛选糖化力较好且具有产蜜香能力的功能菌株。

1.2.1.2 鉴定

菌株形态学观察：将经活化的菌株用接种环划线接种于PDA 培养基上，28 ℃培养5 d，观察菌落形态特征，并用光学显微镜和扫描电镜观察菌丝及其孢子形态特征。

分子生物学鉴定：使用真菌DNA 基因组试剂盒提取筛选菌株的基因组DNA，利用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')、ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') 扩增基因组DNA。PCR 反应体系为50 μL，包括10×PCR Buffer 5 μL，脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTPs) (2.5 mmol/L) 4 μL，模板5 μL，Taq DNA 聚合酶1 μL，引物各1 μL，补充去离子水至50 μL。PCR 反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共30 个循环；72 ℃再延伸7 min。PCR 扩增产物使用1.0 %的琼脂糖进行验证后，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测序结果在美国国家生物技术信息中心(national center of biotechnology information,NCBI)数据库中进行相似性比对，采用Blast程序进行同源性序列分析。

1.2.1.3 性能及安全性评价

表型安全性评价：将菌株接种于PDA 培养基上，28 ℃培养7 d 后，将培养基与培养物切碎，转移至50 mL 无菌离心管中，加入30 mL 的80 %甲醇，超声30 min，8000 r/min 离心20 min，取上清液，参考GB 5009.22—2016《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B 族和G 族的测定》[4]、GB 5009.240—2016《食品安全国家标准食品中伏马毒素的测定》[5]及GB 5009.96—2016《食品安全国家标准 食品中赭曲霉毒素A的测定》[6]，使用免疫亲和柱净化高效液相色谱法对常见真菌毒素黄曲霉毒素B1、B2，伏马毒素B1、B2，赭曲霉素A进行检测。

基因型安全性评价：对菌株进行全基因组测序，并通过KEGG、NR、GO 等多个数据库进行比对，完成基因组预测及功能注释，选取已发表的常见真菌毒素进行比对注释，对相关生物信息进行分析。

1.2.2 功能菌株的生长条件优化

1.2.2.1 生长条件单因素试验

功能菌株于PDA 斜面活化后，用无菌水洗涤孢子，制成浓度为107～108个/mL 的孢子悬液，将其接种至基础培养基中，考察不同培养条件对菌株生长的影响。首先采用单因素试验考察培养基成分（碳源、氮源和无机盐）对菌丝干重的影响，具体因素与水平见表1。

表1 单因素及其试验水平

1.2.2.2 Plackett-Burman试验

在确定碳源、氮源以及无机盐种类的基础上，选取影响菌丝干重的培养基成分（碳源、氮源和无机盐）和培养条件（培养时间、pH 值、接种量、装液量、转速和温度）共9 因子进行Plackett-Burman 试验设计，筛选出对生长影响最大的几个因素，本实验选用N=12的Plackett-Burman实验设计。以菌丝干重为试验指标，评价各个参数对干重的影响，并筛选出主要因素。用Design-Expert 软件进行数据处理，比较各因素的t值和可信度。

1.2.2.3 最陡爬坡试验

依据Plackett-Burman 试验获得的回归模型和试验经验设定装液量、酵母浸粉、纤维二糖3 个因素的步移方向和步长，其余条件按照单因素最优值进行，以菌丝干重为评价指标，最终确定后续响应面试验中的显著因素范围，确定试验设计的中心点。

1.2.2.4 响应面试验

在最陡爬坡试验结果的基础上，采用Box-Behnken 试验设计对纤维二糖、酵母浸粉以及装液量进行优化，以菌丝干重为响应值，每个因素的3个水平以（-1，0，+1）编码，每个试验点进行3 组平行试验。Box-Behnken 试验设计的因子与水平见表2。

表2 响应面试验因素水平设计表

1.2.3 功能根霉曲的制备

称取500 g 麸皮，加入300 g 蒸馏水，充分混匀，121 ℃，30 min，趁热轻摇，打散结块，冷却至30～35 ℃，制成麸曲培养基备用。将按照1.2.2 优化生长条件培养的种子液按照8 %的接种量添加至麸曲培养基，30 ℃培养3～5 d，待菌丝长满黑色孢子，密集且麸皮成饼后，进行扣瓶，继续培养20～24 h。将培养好的麸皮发酵物于40～45 ℃烘干48 h，使用研磨仪对接种有米根霉的干燥麸皮发酵物进行研磨，制成功能根霉种曲，并完成手工扩培，获得功能根霉曲。以功能根霉曲作为实验组，商业根霉曲作为对照组，每组三个平行，从理化指标、微生物和试饭实验三个方面对根霉曲质量进行分析。

1.2.4 功能根霉曲微生物群落结构解析

选取功能根霉曲与商业根霉曲样品，每份样品随机取样3 次，每次2 g，组织研磨仪充分研磨后用真菌DNA 提取试剂盒对样品微生物群落总DNA进行抽提，利用微量核酸蛋白分析仪检测DNA 浓度及纯度。对ITS1F-ITS2R 基因1、2 可变区进行PCR 扩增。利用Illumina 公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250 平台进行测序，测序与建库由上海美吉生物医药科技有限公司完成。使用UPARSE 软件（http://drive5.com/uparse/，version 7.1）对优化序列提取非重复序列，便于降低分析中间过程冗余计算量（http://drive5.com/usearch/manual/dereplication.html），去除没有重复的单序列（http://drive5.com/usearch/manual/singletons.html)，按照97%相似性对非重复序列（不含单序列）进行OTU 聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU 的代表序列。利用RDP classifier (http://rdp.cme.msu.edu/，version 2.2)对每条序列进行物种分类注释，比对Unite（Release 8.0,http://unite.ut.ee/index.php）的真菌数据库。

1.2.5 根霉曲理化分析与试饭实验分析

理化指标分析：水分、酸度和糖化力测定，参照李洪媛等的方法[8]。

试饭实验：参考严启梅等[9]的文献进行实验，同时观察发酵产物的外观，测定试饭糖度并进行感官分析。

1.2.6 功能根霉曲酿酒中试实验

1.2.6.1 功能根霉曲扩培与质量分析

将筛选得到的功能米根霉参照1.2.2 和1.2.3 进行菌株培养及根霉曲制备。扩培时按照0.3 %～0.5 %的接种量（以麸皮计）添加，30～35 ℃培养72 h，培养12～72 h 期间，每6～8 h 翻曲1 次。培养结束时曲料中菌丝粗壮密布，连接成块。将曲料打碎，烘干，备用。

理化实验与试饭实验方法参考1.2.5方法。

1.2.6.2 糖化料分析方法

取5 g 样品加入20 mL 超纯水，振荡混匀后，超声浸提30 min，8000 r/min 离心10 min。取上清液，20 mL 样品瓶中加入8 mL 上清液、内标物（四甲基戊醇，浓度为125 mg/L）和3 g NaCl，迅速拧紧并封好瓶盖，配制成待测液，供上机分析备用。萃取、气相及质谱条件与1.2.1.1相同。

1.2.7 统计分析

利用SPSS 18.0 软件和Design Expert 进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 功能菌株筛选及鉴定

2.1.1 功能菌株的筛选

利用梯度稀释和平板涂布法先后从原料、麸曲、糖化料样品中分离纯化出41 株米根霉菌株，其中原料中获得6 株，麸曲中获得16 株，糖化料中获得19 株。对41 株菌株进行糖化性能及产蜜香能力评估，分离菌株中14 株糖化力＞250，其中3 株糖化力＞350，表现优异。专业术人员对糖化力显著的3株菌株发酵液香气进行感官评价，发现3 株菌株发酵液均具有水果香、花香等香气，其中1 株发酵液蜜香风味浓郁突出。利用SPME-GC-MS 测定该菌株发酵液挥发性香气成分，将得到的挥发性风味物质的质谱数据与NIST14 标准库进行对照匹配，取匹配度大于80 的化合物保留，用于定性分析；定量分析采用峰面积归一化法计算各成分相对百分含量,参考刘登勇等[13]的方法，采用相对气味活度值法（relative odor activity value，ROAV）评价各挥发性成分对样品总体香气的贡献，鉴定结果见表3。

表3 蜜香风味突出菌株挥发性香气成分SPME-GC-MS鉴定结果

结果显示，该高产蜜香风味物质的菌株，发酵液中共检测出挥发性物质27 种，包括醇类13 种，酯类4 种，酮类2 种，酚类1 种，烃类3 种，其他4 种。其中，3-甲基-1-丁醇（异戊醇）、β-苯乙醇、2-甲基-1-丙醇（异丁醇）、苯乙酮以及四甲基吡嗪的ROAV 值均大于1，是发酵液中的关键风味化合物。值得注意的是，ROAV 值较大的β-苯乙醇具有蜜香、玫瑰花香、月季花香、花粉香等香气，这与发酵液蜜香，感官评价结果相吻合。综合糖化性能、挥发性物质和感官指标，将筛选出的糖化力较高且发酵液有显著蜜香香气的菌株，编号为BC 70107菌株，确定该菌株应用于后续馥郁香型白酒用根霉曲的生产。

2.1.2 功能菌株的筛选

将功能菌株BC 70107 接种于PDA 培养基上，28 ℃恒温培养5 d，观察菌落形态特征，并用光学显微镜和扫描电镜观察菌丝及其孢子形态特征。结果如图1 所示。菌落疏松或稠密，最初呈白色，后变为灰褐色或黑褐色；菌丝匍匐爬行，无色；假根发达，分枝呈指状或根状；孢囊梗直立或稍弯曲，2～4 株成束，与假根对生，有时膨大或分枝，呈褐色，长210～2500 μm，直径5～18 μm，囊轴呈球形或近球形或卵圆形，呈淡褐色，直径30～200 μm；囊托呈楔型；孢子囊呈球形或近球形，后期呈黑色，直径60～250 μm。

图1 菌株BC 70107菌落及显微形态照片

应用十六烷基三甲基溴化铵（Cetyltrimethylammonium Bromide，CTAB）法提取菌株基因组DNA，通过真菌通用引物扩增18S rDNA 部分序列、ITS1-5.8S-ITS2 全部序列和28S rDNA 部分序列（rDNA-ITS 序列）并测序，结果在NCBI 数据库进行同源性比对分析，进一步确定为米根霉。

2.1.3 功能菌株安全性评价

对米根霉BC 70107 培养物进行真菌毒素检测，在培养物中未检出黄曲霉毒素B1、B2，伏马毒素B1、B2，赭曲霉素。对菌株进行全基因组测序，并通过数据库进行比对，完成基因组预测及功能注释等相关生物信息分析，结果见表4。

由表4 可知，米根霉BC 70107 基因组未有相关匹配基因和基因注释信息，可以认为米根霉BC 70107 不存在PKS 或者NRPS 代谢合成的相关基因及代谢途径。综合表型和基因型分析结果验证了米根霉BC 70107的安全性[14]。

表4 典型真菌毒素主要合成途径与基因及其与BC 70107基因组比对结果

2.2 功能菌株米根霉BC 70107的生长条件优化

2.2.1 单因素实验

基于探究产蜜香米根霉在馥郁香型白酒酿造中的应用，分析其最佳生长条件，为后期菌剂的制备提供参考。以基础培养基为对照，优化碳源、氮源和无机盐，得到较高米根霉菌丝干重。采用独立样本t 检验判断实验组与对照组间的显著性差异，单因素实验结果见图2。

图2 单因素实验结果

试验结果表明，米根霉BC 70107 对碳源利用广泛，以纤维二糖为碳源时，菌丝干重最高，能达到1.00 g/100 mL，因此选取20 g/L 添加量的纤维二糖用于后续试验。不同的氮源对菌丝产生量的影响较大，酵母浸粉为氮源时菌丝干重最高，能达到0.70 g/100 mL，因此选择10 g/L 添加量的酵母浸粉用于后续试验。在额外添加FeSO4时菌株生长良好，菌丝干重能达到1.42 g/100 mL，因此选用额外添加量为1 g/L FeSO4的无机盐用于后续试验。

2.2.2 Plackett-Burman试验

根据单因素实验结果，设计了11 因素N=12 的Plackett-Burman 实验，试验设计及试验结果如表5所示，方差分析见表6，每组试验的响应值取3 次重复试验的平均值。

表5 Plackett-Burman试验结果

利用Design-Expert 软件进行回归分析，各因素对菌丝干重影响的一次回归方程为：

Y=1.15+0.207A+0.288B-0.054C+0.115D+0.338E+0.040F-0.043G-0.110H-0.102J

由表6 可知，该试验模型的P=0.0347＜0.05，表明该模型是显著的；相关系数R2=0.9922，表明预测值与试验值高度相关，方程能较好的解释变量响应值；调整决定系数R2adj=0.9571，表明该方程的拟合度较好。9个因素对响应值影响的显著顺序为装液量＞酵母浸粉＞纤维二糖＞pH 值＞转速＞发酵时间＞FeSO4＞温度＞接种量，其中装液量的影响最为显著，酵母浸粉、纤维二糖有显著影响，且三者对菌丝量的影响均呈正效应，因此选取这3 个因子进行下一步试验。

表6 Plackett-Burman试验结果方差分析

2.2.3 最陡爬坡试验

根据Plackett-Burman 试验结果，确定各因素最陡爬坡试验的方向和步长，试验设计及结果见表7。

由表7 可知，随着装液量、酵母浸粉、纤维二糖的变化，菌丝干重呈现先上升后下降的变化趋势。当纤维二糖为45 g/L、酵母浸粉为35 g/L、装液量为125 mL 时，菌丝干重最大，达2.13 g/100 mL，因此选择第6 组中的因素水平为中心点，进行Box-Behnken响应面设计。

表7 最陡爬坡试验设计及结果

2.2.4 响应面试验

设计3 因素3 水平的Box-Benhnken Design 响应面试验，共17组试验。Box-Behnken试验设计与结果见表8，对试验结果数据进行多元二次回归拟合，分析结果见表9。

表8 响应面试验设计与结果

拟合得到的二次回归方程为：

R=2.10-0.053A+0.029B-0.204C-0.06AB +0.05AC-0.008BC-0.191A2-0.159B2-0.049C2

由表9可知，回归模型的决定系数R2=0.9324，F值=10.72，P 值=0.0025＜0.01，达到极显著水平，失拟项的P 值=0.0537（＞0.05），失拟项不显著，说明方程的拟合程度较好，可以用该方程确定菌株生产的最佳条件。另外，一次项C 的P 值=0.0002（＜0.01），说明装液量对菌株生长影响极显著。根据二次回归方程得到的响应面图如图3所示。

表9 响应面试验结果方差分析

图3 因素两两交互作用对菌丝干重影响的等高线图（左）和响应面图（右）

由该模型得到的最佳发酵条件为：纤维二糖42.1 g/L、酵母浸粉为36.7 g/L、硫酸亚铁1.0 g/L、温度28 ℃、培养时间3 d、转速120 r/min、接种量2%、装液量110 mL，根据最佳培养条件对模型进行验证，3 次平行试验获得的菌丝干重平均值为2.32 g/100 mL，与理论预测值接近，说明该模型能较好地反应筛选因素对菌丝干重的影响，在优化条件下，菌丝干重较优化之前提高了2.36倍。

2.3 功能根霉曲质量分析

2.3.1 功能根霉曲理化及微生物指标分析

以市售商业根霉曲为对照，对米根霉BC 70107 制备的功能根霉曲（实验组）的水分、糖化力和酸度理化指标及米根霉活菌数微生物指标进行检测，测定结果见表10。

表10 功能根霉曲理化及微生物指标检测结果

结果表明，与商业根霉曲（对照组）相比，米根霉BC 70107 制备的功能根霉曲糖化力有所提高，酸度明显下降，米根霉活菌数是对照组的7.75 倍，相差近一个数量级。

2.3.2 试饭实验

以市售商业根霉曲为对照，根霉曲试饭实验两组样品观察均出现变软、体积变小、出汁，具体结果见表11。

表11 试饭试验结果

由表11 可知，功能根霉曲糖化力与对照组无显著差异，感官具有更为突出的蜜香特征。综合各项指标和试饭实验结果，功能根霉曲质量优于市售馥郁香型白酒用商业根霉曲并且可能会在糖化过程中产生更加丰富的风味物质和前体物质[15]。

2.4 功能根霉曲微生物群落结构解析

为进一步分析功能性米根霉曲品质，基于ITS序列的高通量测序技术分析实验组与对照组根霉曲真菌微生物群落结构。共得到140 个有效OTU，序列比对后，得到已知的5 个门，12 个纲，25 个目，43 个科，57 个属分类单元，其中丰度大于10%的优势分类单元共有4 种，根霉属占绝对优势（＞80%）。TOP10菌属信息见图4。

图4 功能根霉曲微生物多样性差异

图4 结果显示，在成熟的功能根霉曲样品中，米根霉持续保持优势状态，其丰度远远大于其他菌株，此外，其他优势菌株包括念珠菌属（Diutinasp.）、丝孢酵母属（Trichosporon sp.）、Dipodascaceae sp.、伊萨酵母属（Issatchenkia sp.）等；对照组米根霉相对丰度显著降低，念珠菌属（Diutina sp.）、丝孢酵母属（Trichosporon sp.）、Dipodascaceae sp.、伊萨酵母属（Issatchenkia sp.）等相对丰度占据近50%。一方面可以推测实验组与对照组共有菌株来自于外部自然环境、粮食、操作工具等途径，一方面也说明商业根霉曲活力相对较弱，无法始终保持优势状态，致使发酵后期体系中污染大量杂菌，与商业根霉曲酸度较大的结果相互印证。

2.5 功能根霉曲酿酒中试实验

2.5.1 扩培小曲质量分析

对菌种扩培工序中实验小曲质量进行5 批次持续追踪，结果见表12。

表12 中试实验成曲质量分析

功能根霉曲扩培小曲糖化力达到419 mg/g·h，酸度为0.7 mmol/10 g，与对照组相比具有糖化力高、酸度低的特点，达到一级曲标准。

2.5.2 糖化料风味物质分析

经预处理，采用SPME-GC-MS 对使用功能根霉曲与商业根霉曲发酵制备的糖化料中的挥发性物质进行分析，结果如表13所示。

由表13 可知，对照组糖化料丁酸、丙酸、乙酸乙酯、庚酸乙酯、己酸丁酯等含量显著高于功能根霉曲，丁酸的含量是功能根霉曲糖化料的5.5 倍，易产生不良风味。推测可能是市售商业根霉曲存在一定量的杂菌，糖化过程导致酸类、酯类物质明显增多。功能根霉曲糖化料中苯乙酸乙酯、β-苯乙醇、苯乙醛等物质的含量显著高于商业根霉曲，使得糖化料具有蜜香、花香的风味特点。

表13 糖化料中主要挥发性物质 (mg/L)

3 结论

从酒鬼酒股份有限公司酿酒环节中的原料、麸曲、糖化料中定向分离筛选出1 株糖化力较高且高产蜜香功能菌株，编号为BC 70107，经鉴定为米根霉，同时通过表型和基因型分析验证了其安全性。

通过单因素试验、Plackett-Burman 试验、最陡爬坡试验及响应面试验，对米根霉BC 70107 的生长条件进行优化，获得最佳发酵条件为：纤维二糖42.1 g/L、酵母浸粉为36.7 g/L、硫酸亚铁1.0 g/L、温度28 ℃、培养时间3 d、转速120 r/min、接种量2%、装液量110 mL。该条件下获得的菌丝干重平均值为2.32 g/100 mL。

将米根霉BC 70107 制备成种曲，并完成手工扩培，与市售商用根霉曲相比，其糖化力、酸度、米根霉活菌数及试饭实验结果均表现优异。微生物多样性差异结果显示功能根霉曲米根霉丰度远远大于其他菌株，菌株优势明显。

经扩培后的功能根霉曲糖化力达到419 mg/g·h，酸度为0.7 mmol/10 g，评级指标达到一级曲标准。将其应用于馥郁香型白酒生产过程中，糖化料中苯乙酸乙酯和β-苯乙醇等蜜香风味物质含量显著高于对照组，证明米根霉BC 70107 具有高糖化力和高产蜜香风味的特点，是一株性能优良的酿酒用糖化菌株，可通过工艺进一步诠释馥郁香型白酒独特的蜜甜风格。