AA-CYP表氧化酶代谢产物对胰岛β细胞增殖和细胞周期的影响

玉斯日古楞，白兆星，吴贞思，陈彦汝，么宏强

(1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010011 ； 2. 农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010011)

花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)是一种人体必需脂肪酸，也是一种多不饱和脂肪酸，是在生物体内分布最广、含量最丰富的一种脂肪酸。在心血管系统中，细胞色素P450(Cytochrome P450,CYP)是代谢AA的主要酶类。AA经过细胞色素P450表氧化酶途径生成环氧二十碳三烯酸(Epoxyeicosatrienoic acids,EETs)和20-羟基二十碳四烯酸(20-hydroeicosatetraenoic acid,20-HETE)，这些代谢产物具有较强的生物活性[1-4]。

随着人们生活水平的提高，糖尿病的发病率越来越高，糖尿病所导致的心脑血管系统和肾脏等并发症也明显增多。糖尿病的主要病理生理问题是胰岛素抵抗和胰岛β细胞损伤[5]。研究发现，EETs与糖尿病的发生有密切关系，在防治糖尿病过程中具有重要作用[6]。20-HETE在糖尿病、心血管疾病、肿瘤等疾病的发生发展进程中也具有非常重要的作用[6-8]。有研究表明，11,12-EET和14,15-EET有很强的促进有丝分裂作用，它们可以有效促进肾脏内皮细胞的有丝分裂[9-10]。那么，EETs和20-HETE是否具有促进胰岛β细胞增殖的作用？目前尚无定论。因此，本试验将探讨EETs和20-HETE对胰岛β细胞增殖和细胞周期的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 细胞来源 胰岛β细胞：MIN6小鼠胰岛β细胞(hz10123)，购自上海沪震生物科技有限公司。

1.1.2 主要试剂 PBS(10010023)、青霉素-链霉素(15140122)、DMEM培养基(11995065)、胰酶-EDTA溶液(25200056)和胎牛血清(10270106)，均购自Gibco公司；20-HETE、11,12-EET(ab141537)、14,15-EET(ab141538)、LY 294002和PI3-kinase抑制剂(ab120243)，均购自Abcam公司；20-Hydroxy(H3023)，购自Sigma公司；HRP标记羊抗小鼠二抗(BA1051)，购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.1.3 主要仪器 流式细胞分析仪，购自Beckman公司；微量移液器，购自Eppendorf公司；二氧化碳(CO2)培养箱(3111)和离心机(MICROCL 17)，均购自Thermo公司；生物安全柜(BS-1300IIA2)，购自苏州安泰空气技术有限公司；倒置荧光显微镜(CKX41)，购自OLYMPUS公司。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞培养及传代 MIN6细胞采用胰酶消化、PBS清洗后，加入培养液制成细胞悬液。取适量细胞悬液进行台盼蓝染色，在倒置显微镜下计数活细胞并计算细胞密度。取2×106个细胞，加10 mL新鲜DMEM培养基至10 cm培养皿中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞密度达到90%以上时，进行试验，其余细胞冻存备用。

1.2.2 CCK-8试验检测细胞增殖 将细胞接种到96孔板上，每孔的细胞数量调整到约2×104个。培养12 h后将细胞分组处理(表1)，即分别加入不同浓度EETs或不同浓度比的20-HETE/EETs(1∶10和1∶20)，每组3个重复。在不同时间点(培养12、24 h和48 h)收取细胞样品，采用CCK-8方法检测细胞的增殖情况，测定OD450 nm值，以明确EETs和20-HETE/EETs对β细胞增殖的影响是否具有时间和浓度依赖性。

表1 细胞分组和处理Table 1 Cell grouping and treatment

1.2.3 流式细胞术检测细胞周期 将细胞接种到6孔板上，每孔的细胞数量约3×105个，培养12 h后分组处理细胞(表2)。继续培养12 h后，胰蛋白酶消化、收集细胞，PBS清洗2次，使用预冷的75%酒精4 ℃固定过夜。离心去上清，PBS清洗、重悬，加入终浓度为50 μg/mL的RNase，37 ℃消化30 min后，加入碘化丙啶(PI)染色液避光放置20 min，最后上流式细胞仪检测细胞周期。用CellQuest软件、ModFit软件分析试验结果，统计分析各组细胞周期的分布。

表2 细胞分组和处理Table 2 Cell grouping and treatment

1.2.4 Western blot检测细胞增殖相关信号转导通路 为探索EETs和20-HETE/EETs对胰岛β细胞增殖影响的信号转导机制，采用信号转导通路抑制剂干预处理β细胞增殖(表3)，即给予β细胞EETs和20-HETE/EETs刺激的同时，给予PI3K/AKT信号转导通路的抑制剂(LY294002，终浓度为15 mmol/L)，孵育24 h后，收集细胞，提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。蛋白变性10 min，按配方配制SDS-PAGE胶，电泳，转PVDF模，室温封闭2 h，加一抗4 ℃孵育过夜；次日加二抗于摇床上室温孵育2 h。加ECL化学发光混合液，曝光显影，使用Image J软件分析蛋白质条带的灰度值，统计分析蛋白表达量。

表3 细胞分组和处理Table 3 Cell grouping and treatment

1.2.5 数据统计处理 应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，每个试验重复3次，数据以“平均值±标准差”方式表示，单因素多组之间比较采用One-way ANOVA，之后组间比较采用t检验，以P<0.01表示差异极显著，P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 对细胞增殖的影响 胰岛β细胞经过传代、计数、分组，用EETs和20-HETE/EETs分别处理，12、24 h和48 h时进行CCK-8检测。结果如图1所示，在12、24 h和48 h时，与空白组(B组)相比较，溶剂组(C组)对胰岛β细胞增殖的影响均不显著(P>0.05)，说明溶剂对胰岛β细胞增殖无影响。与空白组(B组)相比较，在12 h和24 h时，浓度为100 nmol/L的14,15-EET(E组)对胰岛β细胞增殖具有极显著促进作用(P<0.01)，其中12 h时差异最大(图1A);在48 h时，各组间没有明显差异性(P>0.05)(图1C)。

图1 胰岛β细胞的增殖情况Fig.1 Cell proliferation of pancreatic β cellsA:12 h; B:24 h; C:48 h与空白组(B组)比较，*：P<0.05，**：P<0.01；下同Compared with the blank group(group B)，*：P<0.05，**：P<0.01. The same as below

2.2 对细胞周期的影响 流式细胞术检测结果如图2所示，与空白组(A组)比较，浓度为100 nmol/L的11,12-EET处理组(C组)胰岛β细胞中G0/G1期细胞由(51.27±1.48)%减少至(42.57±1.06)%；而S期细胞由(28.81±1.89)%升高至(33.17±1.42)%；G2/M期细胞由(19.92±0.64)%升高至(24.26±0.83)%，两组间均差异显著(P<0.05)；浓度为100 nmol/L的14,15-EET处理组(D组)胰岛β细胞中G0/G1期细胞由(51.27±1.48)%减少至(44.92±1.85)%，两组间差异显著(P<0.05)；S期细胞由(28.81±1.89)%升高至(29.01±1.87)%，但差异不显著(P>0.05)；G2/M期细胞由(19.92±0.64)%升高至(26.07±1.03)%，两组间差异显著(P<0.05)。

2.3 影响细胞增殖的机制 细胞使用不同浓度EETs、20-HETE/EETs和抑制剂LY294002处理后，采集细胞、提取蛋白，采用Western blot检测AKT磷酸化水平和PI3K活化状况。结果如图3所示，与空白组(A组)相比较，EETs处理组(C组和D组)的PI3K表达水平显著上升(P<0.05)，当20-HETE/EETs 联合处理(E组和F组)时，PI3K表达水平显著降低(P<0.05)；与未加LY294002组(C组和D组)相比较，LY294002处理组(H组和I组)极显著抑制了PI3K表达水平(P<0.01)。PI3K蛋白表达量在11,12-EET组(C组)和14,15-EET组(D组)之间无明显差异(P>0.05)。

3 讨论

糖尿病的发病率逐年增多,尤其是2型糖尿病的患病率逐渐提高，成为继肿瘤、心脑血管疾病之后的又一个严重危害健康的慢性非传染性疾病[11]，其主要病理生理特点是胰岛β细胞功能衰竭[11-12]。因此，β细胞损伤和功能障碍是糖尿病发生发展的主要原因。也就是说，避免β细胞损失和功能失调是改善糖尿病发展的有效方法[13-14]。研究证明，EETs不仅可以促进大鼠胰岛素的释放，还可以促进肾脏内皮细胞增殖和再生[9，15-16]。此外，研究还发现，11,12-EET和14,15-EET有很强的促进有丝分裂作用，可有效促进肾脏内皮细胞的有丝分裂[9-10]。20-HETE能够调控体内不同的生理作用，在糖尿病、心血管疾病和肿瘤等疾病的进程中也具有重要作用[5]。研究发现，在糖尿病肾病大鼠的肾小球中，CYP4A的表达和20-HETE的产生会明显减少，并且糖尿病大鼠的肾脏受损时，其20-HETE含量会明显减少[6]。可见，EETs和20-HETE均与糖尿病的发生有密切联系，但对它们的具体作用及其机制尚未深入研究。EETs和20-HETE是否可以促进胰岛β细胞的增殖，是否可以保护胰岛β细胞，使其免受损伤或功能失调，从而改善糖尿病的发生发展？目前尚未定论。

图2 EETs和20-HETE对胰岛β细胞细胞周期的影响Fig.2 Effect of EETs and 20-HETE on the cell cycle of pancreatic β cellsA:空白组(A组)流式细胞检测细胞DNA直方图； B:11,12-EET组(C组)流式细胞检测细胞DNA直方图； C:EETs和20-HETE作用后胰岛β细胞细胞周期的变化A:DNA histogram in control group (group A) detected by flow cytometry; B:DNA histogram in 11,12-EET group (group C) detected by flow cytometry; C:Effects of EETs and 20-HETE on cell cycle of pancreatic β cells

图3 EETs、20-HETE/EETs和LY294002处理后PI3K/AKT蛋白的表达水平Fig.3 Expression levels of PI3K/AKT protein after EETs,20-HETE/EETs and LY294002 treatmentA:Western blot 结果； B:PI3K蛋白表达水平的比较[与空白组(A组)比较，*：P<0.05; 与未加LY294002组(C组和D组)比较，#:P<0.05，##: P<0.01]A:Western blot results; B:Comparison of PI3K protein expression levels[Compared with the blank group (group A),*:P<0.05; Compared with the non-adding LY294002 groups (group C and D),#:P<0.05,##:P<0.01]

因此，本试验通过CCK-8方法检测EETs和20-HETE对胰岛β细胞增殖的影响。试验结果显示，在干预12 h和24 h时，浓度为100 nmol/L的14,15-EET对胰岛β细胞的增殖具有极显著促进作用，在12 h时其促进作用最显著。但是，以不同比例联合使用EETs和20-HETE时，对胰岛β细胞的增殖无显著影响。此结果表明，在一定范围内，14,15-EET的作用具有时间和浓度依赖性，这与Xu等[6]的研究结果一致。综上所述，使用14,15-EET干预胰岛β细胞12 h时，细胞增殖可以达到高峰，且其促增殖的最佳浓度为100 nmol/L。但联合使用EETs和20-HETE时，14,15-EET未能显示出上述促增殖的作用。

为进一步探讨EETs和20-HETE影响胰岛β细胞增殖的可能机制，本试验还应用流式细胞术和Western blot方法分别观察细胞周期的变化和PI3K/AKT信号转导通路的激活情况。细胞周期的G1期为DNA合成前期，此期为过渡至S期做准备；S期为DNA合成期，可反映细胞的分裂活力，增殖旺盛的细胞处于S期的比例较高；G2期为DNA合成后期，M期为有丝分裂期，(S+G2M)%为增殖指数，代表了细胞中增殖细胞的数量，在一定程度上可反映细胞的增殖状态。本试验的流式细胞术结果显示，11,12-EET和14,15-EET处理组(C组和D组)的G0/G1期细胞减少，S期与G2/M期细胞增多，说明EETs可能促使静止态的G1期细胞活跃，并向S期转变，使DNA合成量增加，从而促进细胞的增殖。此试验结果进一步验证EETs能够使胰岛β细胞处于增殖状态。Western blot试验结果显示，与空白组(A组)相比较，EETs处理组(C组和D组)的PI3K表达水平显著上升，但20-HETE和EETs 联合使用时(E组和F组)，PI3K表达水平反而显著降低；与未加LY294002组(C组和D组)相比较，当使用PI3K/AKT信号转导通路抑制剂(LY294002)干预11,12-EET和14,15-EET处理组细胞后，显著抑制了PI3K活化状况。此结果提示，EETs能够促进胰岛β细胞的增殖，其分子机制可能是EETs激活了PI3K/AKT信号转导通路，与既往研究结论[5]相一致；同时，本试验结果也进一步说明20-HETE和EETs的联合使用对胰岛β细胞的增殖没有促进作用。

综上所述，本试验证实EETs可促进小鼠胰岛β细胞的增殖(14,15-EET的作用更加显著)，其机制可能是EETs激活了PI3K/AKT信号转导通路，使胰岛β细胞处于增殖状态，且其促进作用具有时间和浓度依赖性。但是，20-HETE和EETs的联合使用，未显示出促胰岛β细胞增殖的作用，其机制有待于进一步深入研究。