基于网络药理学和分子对接探讨肾衰宁治疗糖尿病肾病的有效成分及作用机制

王 娜，梁建庆，冯 鑫，杨伟杰，张媛媛

（1.甘肃中医药大学基础医学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃中医药大学附属医院内分泌科，甘肃 兰州 730000）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最重要的全身微血管病性合并症之一，初始表现为早期肾小球超滤过出现微量蛋白尿，随病程进展出现持续大量蛋白尿、高血压、水肿，肾小球滤过率降低进而肾功能不全。近年来，我国糖尿病患病率显著增加，全国有20%～40%的糖尿病患者合并DN，且目前已成为慢性肾脏病（CKD）和终末期肾病的主要原因[1]。随着中西医结合治疗在DN 的广泛应用，中医药在减轻临床症状、保护肾功能方面展现出越来越大的优势，与此同时中医药在治疗DN 的基础研究成果不断涌现，研究领域也逐渐细化[2-4]。既往研究证实[5-8]，肾衰宁有抑制炎症、改善肾功能及机体营养状态、提高机体免疫功能的作用。但对于肾衰宁治疗DN 的机制的研究局限于单个分子或单条途径的实验室研究，中药复方治疗疾病是多靶点、多途径而实现，单个分子及途径难以全面解释。本研究通过构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图，探寻肾衰宁治疗DN 的潜在靶点和活性成分，并结合分子对接技术验证筛选出的活性成分与其靶点蛋白的亲和关系，预测此复方治疗DN 的作用机制，为肾衰宁治疗DN 提供科学依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 肾衰宁有效成分的筛选 利用中药系统药理学分析平台数据库（https://tcmspw.com/tcmsp.php），设置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug-likeness，DL）≥0.18，对“丹参、大黄、太子参、黄连、牛膝、半夏、红花、茯苓、陈皮、甘草”的有效成分及相关靶点进行筛选，并将靶点基因全称转换为简称。

1.2 肾衰宁作用靶点与DN 疾病靶点的预测 以“diabetic nephropathy”为关键词在GeneCards（http://www.genecards.org/）数据库进行检索，得到DN 相关疾病靶点。将肾衰宁有效成分对应靶点与DN 相关疾病靶点导入Venny 2.1.0 取交集，交集靶点即肾衰宁治疗DN 作用靶点。

1.3 构建“药物-成分-靶点-疾病”网络 将药物和疾病的交集基因输入Cytoscape 3.8.0 软件中，构建“药物-成分-靶点-疾病”可视化网络图，利用cytoNCA插件对网络图节点进行分析，标明的每个节点的属性即为肾衰宁治疗DN 的有效成分。

1.4 蛋白-蛋白相互作用网络的构建与分析 将获得的药物-疾病交集靶基因文件数据导入STRING（http://string-db.org），并将物种限定为“homo sapiens”。选取置信度高于0.95 的数据，完整构建肾衰宁的蛋白相互作用PPI 网络，根据网络中基因与邻接基因的数目，找出网络的核心基因。

1.5 GO 和KEGG 富集分析 将上述药物-疾病交集靶基因使用R 语言包bioconductor 包（http://www.bioconductor.org/）分别进行GO 分析通路KEGG 分析，设定富集分析统计学过滤值（P-value=0.05，Q-value=0.05），筛选结果以生成图表进行可视化。

1.6 分子对接 选择PPI 网络中度值前3 的靶点及药物活性成分，于Pubchem 数据库找寻活性成分3D 构象，使用RCSB 数据库比对活性成分相似配体，筛选出靶蛋白构象结构，导入PyMOL 软件，去除水分子、分离原有配体及各项优化，将优化后的靶蛋白导入AutoDockTools-1.5.6，使对接位点选择以原有配体为中心，设置网格箱（gird box）为默认值，使用AutoDock 模拟活性成分与靶蛋白分子对接，将结果输出并进行分析。采用PyMoL 软件对靶点蛋白和小分子进行可视化处理。

2 结果

2.1 肾衰宁活性成分的筛选 通过TCMSP 数据库检索，以“OB≥30%和DL≥0.18”为条件筛选后得到丹参54 个、大黄6 个、太子参3 个、黄连10 个、牛膝12 个、半夏11 个、红花16 个、茯苓15 个、陈皮5个、甘草85 个，共得到肾衰宁有效成分217 个。

2.2 肾衰宁作用靶点与DN 疾病靶点信息 利用TCMSP 数据库预测得到的肾衰宁成分靶点经Uniprot 数据库基因注释后得到的Symbol 文件共241 个注释基因；通过GeneCards 数据库检索后得到3397 个与DN 相关的基因，取肾衰宁与疾病的交集靶点，共获得161 个交集基因，见图1。

图1 药物成分与疾病的交集基因

2.3 “药物-成分-靶点-疾病”网络 利用Cytoscape 3.7.2 绘制肾衰宁治疗DN 的“药物-成分-靶点-疾病”网络图，共含有355 个节点和2722 条边，见图2；通过CytoNCA 分析发现肾衰宁中前10 的活性成分为槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山奈酚（kaempferol）、黄芩素（baicalein）、β-谷甾醇（betasitosterol）、柚皮素（naringenin）、豆甾醇（stigmasterol）、汉黄芩素（wogonin）、丹参酮ⅡA（tanshinone iia）、川陈皮素（nobiletin）。

图2 肾衰宁治疗DN 的“药物-成分-靶点-疾病”网络图

2.4 PPI 网络 将共有靶点基因输入STRING 网站，基因类型选择人类（homo sapiens）并设置最小关系值≥0.95，删除无连接节点，生成药物-疾病共有靶点PPI 网络，将结果导出，输入cytoscape3.8.0 软件，进行拓扑参数分析，得出PPI 网络共17 个节点、84 条边，其中度值排名前10 位的靶蛋白为JUN、MYC、FOS、STAT3、MAPK14、HIF1A、ESR1、AKT1、CCND1、MAPK3，见图3。

图3 药物-疾病共有靶点PPI 网络图

2.5 靶蛋白的富集分析

2.5.1 GO 富集分析 将药物-疾病共同靶点输入R语言bioconductor 包中，分别进行分子功能、生物途径功能、细胞成分3 方面的GO 富集分析，取排名前10 的条目制作条形图（图4），其中靶蛋白分子功能主要集中于RNA 聚合酶Ⅱ-特异性DNA-结合转录因子结合、核受体活性、配体-激活转录因子活性、细胞因子活性、细胞因子受体结合、转录共激活因子的结合、磷酸酶结合、血红素结合及转录辅助因子结合等方面；细胞组成涉及膜筏、膜微域、膜区、等离子膜筏、囊泡腔、RNA 聚合酶Ⅱ转录调控复合物、转录调节因子复合物、细胞质囊泡腔及内质网腔得组成成分等方面；生物过程涉及对氧化应激反应、细胞对化学应激的反应、对活性氧的反应、细胞对氧化应激的反应、类固醇激素反应、脂多糖反应、对细菌来源的分子的反应、活性氧的代谢过、药物反应等方面。

图4 药物-疾病共同靶点的GO 生物学过程富集分析

2.5.2 KEGG 通路分析 将药物-疾病共同靶点输入R 语言bioconductor 包中，选取P较小，count 数较大的前30 个通路利用气泡图进行可视化（图5）。富集结果分析得知，肾衰宁治疗DN 是通过多种途径的，与脂质和动脉粥样硬化、人巨细胞病毒感染、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路、化学致癌作用的-活性氧、TNF 信号通路、IL-17 信号通路、HIF-1 信号通路、内分泌抵抗等多种途径相关。

图5 药物-疾病共同靶点的KEGG 富集分析气泡图

2.6 分子对接 筛选PPI 网络中度值前3 的靶蛋白进行分子对接（表1），使用AutoDock 软件进行分子模拟对接的结果。取degree 值前3 的蛋白质与化合物结合进行可视化处理（图6），结果显示各化合物与蛋白对接的结合能均＜0 kcal/mol。

图6 靶蛋白与化合物的结合模式图

表1 活性成分与靶点蛋白结合能

3 讨论

目前DN 发病机制尚未完全明确，有研究认为与血流动力学改变、代谢紊乱、炎症反应、自噬、细胞因子、氧化应激以及遗传因素等密切相关[9]。肾衰宁是由丹参、大黄、太子参、黄连、牛膝、半夏（制）、红花、茯苓、陈皮、甘草10 味中药组成的中成药，具有益气健脾、活血化瘀、通腑泄浊的功效。方中太子参、制半夏、茯苓、陈皮益气健脾，利水渗湿；丹参、红花活血祛瘀，凉血消痈；大黄、黄连重在泻火解毒，燥湿利水；牛膝滋补肝肾，利尿通淋；甘草和中缓急，调和诸药。现代药理学研究发现，丹参注射液能通过抑制氧化应激、炎症反应和纤维化进程来挽救DN[10]；大黄不仅能够抑制高代谢及肾脏代偿性肥大，促进机体排泄，而且能抑制蛋白质分解，促进其大量合成，从而改善氮质血症[11]；黄连能够通过lncRNA CLYBL-AS2-miR-204-5p-SNAI1 轴抑制DN 的上皮-间充质转变和纤维形成，从而改善DN[12]；红花有效成分红花黄色素能够降低心率，提高血糖的比例，改善DN 相关的检测指标[13]；陈皮提取物（OPE）可改善肾功能，显著防止肌酐、尿素和血尿素氮水平的升高，降低肾小管间质纤维化指数[14]；甘草提取物降低血糖水平，恢复肾功能，减轻体重，恢复糖尿病肾脏的总抗氧化能力，对糖尿病有潜在的治疗作用[15]。

本研究得到217 个活性成分，度值前3 的活性成分为槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山奈酚（kaempferol）。研究表明，槲皮素能够抑制DN 肾小球系膜细胞增殖、降低DN 的足细胞凋亡水平从而治疗DN[16-18]；木犀草素通过抑制STAT3 通路，抑制炎症反应和氧化应激，减轻DN 症状[19]，同时抑制超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量和血红素加氧酶-1（HO-1）蛋白表达，从而达到对DN的保护作用[20]；山柰酚能够通过抑制炎症、抗氧化、改善肾纤维化，减轻DN[21-23]。

通过PPI 分析得到17 个核心靶点，度值前3 的靶点为JUN、MYC、FOS。JUN 是具有转录活性的转录因子，高糖环境可使肾脏c-Jun 蛋白的表达显著增加，活化JNK 信号通路，激活的JNK 途径通过磷酸化转录因子和其他目的因子来调节基因转录，诱导Nephrin 表达下调，从而引起足细胞功能异常，导致DN 加重[24]；MYC 作为一种生长转化因子，表达与细胞增殖有密切的关系，可直接参与细胞生长周期的调控[25]，有研究表明减轻C-myc 表达，能够减轻肾脏肥大和纤维化[26]；FOS 家族成员包括c-Fos 和Fos B，在高糖环境下肾小球系膜细胞c-FOS 表达增加，Jun 蛋白与激活蛋白-1（AP-1）形成二聚体，因而表明FOS 在DN 中起重要作用[27]。GO 分类和KEGG 富集分析结果显示，肾衰宁治疗DN 作用的生物学过程主要涉及序列特异性DNA 结合转录因子活性的调控、蛋白质磷酸化及对氧化应激、类固醇激素、脂多糖反应等，通过调控糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、MAPK信号通路、化学致癌作用的活性氧、TNF 信号通路、IL-17 信号通路、HIF-1 信号通路、内分泌抵抗等发挥治疗DN 的作用。最后对筛选得到的活性成分及靶点进行分子对接验证，结果显示肾衰宁与相对应的作用靶点均展现出较好的亲和力，且结合位点均有稳定的氢键，构象稳定，有强烈的结合能力，进一步验证了本研究预测的准确性，也表明肾衰宁可能通过多成分作用于多靶点发挥治疗DN 的作用。

综上所述，本研究通过对肾衰宁治疗DN 作用靶点的生物过程及信号通路进行富集分析，明确了肾衰宁治疗DN 作用的分子机制具有多成分、多靶点、多途径的特点，这为后续实验提供了研究思路。