重组酶介导的油菜茎基溃疡病菌荧光核酸扩增检测体系的建立

陈吴健，张巧琦，魏晓洁，朱青青，郭利川，应清界，梅高甫，曹栋栋*

(1.杭州海关技术中心，浙江 杭州 310016；2.江苏奇天基因生物科技有限公司，江苏 无锡 214000；3.浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所 浙江省数字旱粮重点实验室，浙江 杭州 310021)

油菜茎基溃疡病是油菜上最严重的真菌病害之一，油菜茎基溃疡病菌(Leptosphaeriamaculans)是全世界油菜产区广泛分布的一种危害严重的病原菌，属真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，座囊菌纲(Dothideomycetes)，格孢腔菌目(Pleosporales)，格孢腔菌科(Pleosporaceae)，小球腔菌属(Leptosphaeria)。油菜茎基溃疡病菌不仅侵染油菜，还危害白菜、甘蓝和芥菜等近30种十字花科植物，引起茎基溃疡、植株倒伏和死亡。据估计，全世界每年因油菜茎基溃疡病菌所造成的油菜籽经济损失超过3亿欧元[1-2]。目前该病菌在我国尚未发现，但它可以通过病残体，特别是被侵染的种子等进行远距离传播；近年来我国进口油菜籽主要来源于加拿大、澳大利亚，而我国油菜产区气候与欧、美、澳三大洲相似，目前的油菜主要栽培品种高度感病[1]。因此，加强口岸检疫和监管控制是控制该病菌传入我国的重要手段，是当前我国各口岸植物检疫部门的紧迫任务[3]，亟需建立一种高效快速检测体系来预防油菜茎基溃疡病传入我国。

核酸扩增技术(recombinase aided amplification，RAA)是一种近年来新出现的等温核酸扩增技术[4]，使用从细菌或真菌中获得的重组酶，在37 ℃恒温下与引物紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当模板DNA上搜索到与引物DNA完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白的共同作用下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，合成新的DNA互补链。反应产物以指数级增长，一般在15～30 min内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。整个反应简单快速，不需要高温循环，常温下即可完成所有的反应步骤，当室温低于25 ℃时，只需增加一台水浴设备，所以非常适合在有大量样品的非实验室检测场景使用。目前RAA技术已经应用在食源性微生物检测[4-5]、寄生虫检测[6]、病毒检测[7]等方面，本研究建立了一种应用实时荧光RAA法检测油菜茎基溃疡病菌的方法，对进境口岸快速检测鉴定十字花科种子中携带的油菜茎基溃疡病菌具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 菌株

本研究以油菜上常见的病害及其近似菌株为监测对象，菌株均为杭州海关技术中心植检实验室分离鉴定(表1)。

表1 供试菌株信息

1.2 序列合成

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，获得LMR1-D基因碱基序列，并进行多序列比对，从中选出一段352 bp的保守序列(5′-3′)：TACGCGTAAGAA GCGTGCCTTAGAGTCTATAGGGAGCCGCCTAGGTTG CCCTAACCTAGAATCTATAAGGGGAACCTTAGAGG AGCTAGAGTCCTTATCTTCTAATAAGGAGCTCTAGG CGCCCTTAGCTATAGTATTAGCCTTGCGCGTAAGCT TAGCAGCAGTAGTAGTACCTTTTACTAGCTCCTACT ATTTAGCCTTGCTCTCCTTAAGGAGCACTAAGACCC TCTGCTTCTTATCCTTAAGAAGGTCTTAGCTCTTAC CTGCCTACTTCCTTGCTAGGAAGGATAGCGTAGAAT ATTAGGCAAGCTTAGGGCTATTAGTTTGTTAGTATA GATCTTACTAAGCGTTA。将该序列委托上海生工生物工程有限公司合成，载体Puc57，克隆位点SmaI，宿主菌为DH5α，抗性氨苄。

1.3 特异性引物、探针的设计

以LMR1-D基因序列为模板，根据RAA方法的引物及探针设计要求进行引物设计。

1.4 主要设备和试剂

质粒提取试剂盒(天根)；恒温核酸扩增检测仪(RAA-F1620，江苏奇天基因生物科技有限公司)；球磨仪(莱驰MM400)；恒温振荡混匀仪(RAA-B6100，江苏奇天基因生物科技有限公司)；核酸提取试剂盒(天根)；RAA核酸扩增试剂盒(江苏奇天基因生物科技有限公司)；RAA核酸扩增试剂盒(江苏奇天基因生物科技有限公司)；引物和探针(上海生工生物工程有限公司合成)。

1.5 RAA反应体系和条件

按RAA核酸扩增试剂盒使用说明进行反应体系的配制，总体积为50 μL，其中反应缓冲液25 μL，超纯水16.7 μL，10 mmol·L-1正向引物2.1 μL，10 mmol·L-1反向引物2.1 μL，10 mmol·L-1探针0.6 μL，DNA模板1 μL(阴性对照为水)，充分混合；将混好的缓冲液加到RAA反应单元冻干粉中，使之溶解均匀，瞬时离心；将2.5 μL 280 mmol·L-1醋酸镁溶液加入到干粉管管盖上，放入到恒温振荡混匀仪(RAA-B6100)，设置温度为39 ℃，按短振键，结束后放入恒温核酸扩增检测仪(RAA-F1620)中，设置温度为39 ℃，反应20 min。

1.6 菌株和样品DNA的提取

用PDA平板培养供试菌株，3 d后刮取菌丝加液氮研磨后，称取0.1～0.2 g，用核酸提取试剂盒提取DNA。油菜籽用球磨仪充分粉碎，称取0.1～0.2 g，用核酸提取试剂盒提取DNA。

1.7 特异性验证

在8个反应体系中分别加入1 μL阴性质控品、油菜茎基溃疡病菌、油菜黑胫病菌、芸苔链格孢、链格孢、富氏葡萄孢盘菌、芸苔生尾孢、葡萄茎枯病菌、核盘菌的DNA各1 μL为模板，充分混匀，每管总体积为50 μL，按照RAA荧光扩增体系检测扩增结果。

1.8 灵敏度的确定

将5 μL 1.0×1010拷贝·mL-1油菜茎基溃疡病菌DNA质粒10倍梯度分别稀释成1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101拷贝·mL-14个标准样品；在5个反应体系中分别加入1 μL阴性质控品、4个梯度浓度的标准样品为模板，充分混匀，每管总体积为50 μL，按照RAA荧光扩增体系检测扩增结果。

1.9 油菜籽样品的检测

在8个反应体系中分别加入1 μL阴性对照、2份澳大利亚油菜籽、2份加拿大油菜籽(经过实时荧光PCR检测为阳性)、2份经检测为阴性的本地青菜籽和青花菜籽的DNA各1 μL为模板，充分混匀，每管总体积为50 μL；按照RAA荧光扩增体系检测扩增结果。

2 结果与分析

2.1 引物和探针

探针和引物的序列设计如表2。

2.2 方法特异性检测

用表1中的菌株DNA对方法进行特异性检测，结果如图1所示。只有油菜茎基溃疡病菌样本DNA出现明显扩增信号，其他样本及阴性对照均未检测到扩增。表明本方法具有良好的特异性，可以区分油菜茎基溃疡病菌与其近似种和油菜上常见的病害。

表2 根据LMR1-D基因保守序列设计的引物和探针

图1 RAA检测方法特异性验证结果

2.3 灵敏度验证

用实时荧光RAA检测油菜茎基溃疡病菌DNA质粒制成10倍梯度的标准品，如图2所示，最快1 min就可见明显扩增信号，10 min内所有标准样品均有扩增。以荧光增加量为荧光起始量的30%为阳性判定标准，可以判定该检测方法的检测底限可以达到1.0×101拷贝·mL-1。

图2 RAA检测方法灵敏度检测

2.4 油菜籽样品的检测

实际样品的检测结果表明，阳性对照和加拿大、澳大利亚油菜籽出现明显的阳性扩增曲线，本地青菜籽、青花菜籽和阴性对照均无扩增信号，说明该方法不但可以用于监测油菜茎基溃疡病菌，也可以用于检测进出境油菜及其产品中是否携带油菜茎基溃疡病菌，而且灵敏度、精确度可以与实时荧光PCR相当(图3)。

图3 油菜籽样品检测结果

3 讨论

油菜是我国种植面积第一的油料作物，自2002年以来一直维持在667 万hm2左右，产量达1 000万～1 300万t。油菜茎基溃疡病是油菜上最严重的真菌病害之一，病原菌主要有油菜黑胫病菌和油菜茎基溃疡病菌，二者的形态特征相近，但引起油菜茎部感染和基部溃疡的能力不同。油菜黑胫病菌致病力较弱，一般引起茎中上部为害，造成的损失小，在包括我国在内的一些油菜生产国均有分布[8]。油菜茎基溃疡病菌致病力强，引起茎基部发病，是导致油菜黑胫病严重流行和油菜产量损失的主要因素，在加拿大、澳大利亚、美国、欧洲等油菜主产国均有分布，而在我国未见报道[8]。1975—1995年，油菜茎基溃疡病菌在加拿大大面积扩散开来，并从美国传入墨西哥，接着向东扩散，蔓延至大部分欧洲国家[8-10]。因此，随着国际贸易的发展，带菌的油菜籽以及病残体可能随着大宗的油菜籽进口而进入中国，一旦传入我国，将对我国油菜产业造成巨大损失。

由于国内油菜籽榨油业产能的扩张迅速，我国油菜籽产量远远不能满足加工需求，且国外价格较低的油菜籽更加刺激了油菜籽进口。据进出口数据显示，2021年我国油菜籽进口数量为264.64万t，主要来自加拿大、澳大利亚；因此，油菜茎基溃疡病菌传入我国的风险日益增大。上海、厦门以及浙江的多个口岸曾多次从加拿大、澳大利亚进口的油菜籽、青菜籽中截获到油菜茎基溃疡病菌[11-13]。为了保护我国油菜产业的健康发展，2007年我国将油菜茎基溃疡病菌列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，用检疫手段严防其传入。

目前实验室检测油菜茎基溃疡病菌的技术主要包括传统方法，如分离培养法[11]；分子生物学方法，如聚合酶链式反应(PCR)法[13-15]、环介导等温扩增(LAMP)法[12,16]等。分离培养法周期较长，操作繁琐，较难满足当前快速通关的要求；PCR技术具有快速、特异性强、灵敏度高的优点，是目前我国口岸筛检油菜茎基溃疡病菌的重要手段之一[2]，但需昂贵仪器，装备精良的实验室和专业的操作人员；LAMP法所需仪器设备简单，等温灵敏、特异性强、操作简单且易于观察结果，但是LAMP技术要求多对引物且对靶基因的要求较高。

本研究建立了油菜茎基溃疡病菌的实时荧光重组酶介导扩增检测方法，克服了以上的缺点，并通过样品的验证表明，该方法方便快捷、灵敏度高、特异性强，能够检测到1.0×101拷贝·mL-1的DNA，整个检测过程为5～20 min，能够满足进出境十字花科种子及其产品快速通关的要求。