浙江地区非洲菊菌核病的病原鉴定及品种抗性鉴定

方丽，叶琪明，郭方其，谢昀烨，吴超，武军，王汉荣*

(浙江省农业科学院a 植物保护与微生物研究所，b园艺研究所，浙江 杭州 310021)

非洲菊为菊科大丁草属多年生草本植物，又称扶郎花、太阳花、灯盏花等，其色泽艳丽，花型优美，花色多样，花期长，不易衰败，具有极高的观赏价值和经济价值，是深受大众欢迎的鲜切、盆栽和庭院观赏植物[1]。菌核病是非洲菊生产上危害最为严重的土传病害，造成死苗缺株，长势衰弱，每年导致产量损失率为10%～30%,严重影响花农和花企的经济效益和生产积极性。而种植抗性品种是预防非洲菊菌核病发生的最经济有效的途径。然而尚未有关于非洲菊菌核病的品种抗性的系统研究，包括接种方法、抗性评价等相关报道。为了促进非洲菊抗病性育种的发展，本文对目前侵染非洲菊的菌核病菌进行鉴定，以非洲菊的主栽和新引进品种为对象，建立对菌核病的抗性水平和评价方法，并对21个品种进行抗性鉴定，为非洲菊的抗菌核性育种研究提供理论基础和技术支持。

1 材料与方法

1.1 病原菌的分离纯化

供试的非洲菊菌核病菌为浙江省嘉兴地区海宁种植基地的优势菌株，通过组织分离方法[2]，从自然发病的非洲菊病株中分离纯化获得，致病力强。人工接种后，经相同方法分离获得菌种。

1.2 病原菌的分子鉴定

将菌核病菌移至新的PDA培养基上，25 ℃黑暗培养5 d后，刮取菌丝，用Invitrogen 的HyPure真菌基因组DNA提取试剂盒Genenode提取菌核病菌的基因组DNA。采用16S rDNA基因(ITS5/ITS4 GGAAGTAAAAGTCGTAAGG//TCCTCCGCTTA TTGATATGC)[3]，扩增相应基因序列。引物合成及测序工作由北京擎科生物科技有限公司杭州分公司完成。利用软件MEGA7.0将分离到的菌株与已发表的菌核病菌菌株构建系统发育树，分析菌株间的遗传关系。

1.3 接种方法

将菌核病菌接种于新的PDA培养基上，置于25 ℃霉菌培养箱，黑暗培养4 d后，沿菌落边缘用打孔器打出直径为5 mm的菌块。将菌块置于非洲菊植株的叶柄底部，每株1个菌丝块，每个品种接种30株左右。用透明塑料膜保湿培养48 h，接种后每天观察并记录植株发病情况。

1.4 供试品种(系)及抗性鉴定方法

2021年春季，供试非洲菊品种包括世纪红、水粉和桃红3个常规种植品种，以及理想、太阳风暴、绿球50、拉丝6号、金桂50、拉丝1号、拉丝8号、拉丝4号、粉佳人、大雪桔、亮粉、美满、香槟、粉拉丝、福娃、黑杰克、安娜柯莱托和安迪奶油18个新引进的品种。非洲菊种植于浙江省农业科学院桑园基地大棚内的箱式框内。选取苗龄为3个月左右成株，用菌丝块方法(同上)接种菌核病。2021年11月3日接种，前后1个月内不使用任何杀菌剂，其他栽培管理如常。设置清水对照。

1.5 非洲菊菌核病病级分级标准

根据非洲菊菌核病发生发展规律的调查分析，参考油菜菌核病和白菜菌核病[4-5]的抗性分级和评价标准，采用植株发病情况与菌丝菌核形成情况相结合确定分级标准。0级为全株无病；1级为部分叶片萎焉，≤5%叶片枯死；3级为部分叶片萎焉或有病斑，枯死的叶片占总叶片数的5%～10%；5 级为10%～25%叶片萎焉或枯死，或枯死叶片或花葶出现白色菌丝或菌丝团；7级为25%～50%叶片萎焉或枯死，或枯死叶片或花葶出现白色菌丝或菌丝团；9级为50%以上的叶片萎焉或枯死，或心叶萎焉，花葶倒伏，叶片或花葶出现菌丝团或菌核。

1.6 非洲菊菌核病病情调查方法

病情调查一般在接种后20～25 d，也可根据对照品种发病至最高病级时的时间作适当调整。每小区均调查全部植株，调查发病株数和发病病级并记录。

1.7 菌核病抗感的划分

根据上述病情指数，将其划分为6个类型。免疫(I)：无病；高抗(HR)：病情指数为0～10；抗病(R)：病情指数为>10～30；中抗(MR)：病情指数为>30～50；感病(S)：病情指数为>50～70；高感(HS)：病情指数为>70～100。

2 结果与分析

2.1 非洲菊菌核病的田间症状

菌核病发病初期表现为老叶枯死增加，长势衰弱，分蘖减少，随着病原菌的进一步侵入，多个叶片萎焉，叶片出现枯黄色的枯死病斑，甚至新叶或花葶萎焉，全株枯死。在湿度高时可见发病部位出现大量白色菌丝和菌核。低温高湿有利于促进菌核病的发生[6]，秋冬季为非洲菊菌核病发生的主要时期。

2.2 非洲菊的菌核病菌的形态鉴定

菌核病菌菌株在PDA平板上25 ℃黑暗培养下生长迅速，放射状生长，平铺于培养基表面，生长速度为2.3 cm·d-1。菌丝白色，长絮状，随着培养时间的增加，菌落边缘菌丝集结成团，初为白色，后渐变为黑色，表面粗糙，圆形或不规则形菌核，直径2～10 mm(图1)。

图1 非洲菊菌核病田间症状及病原菌在PDA上的生长情况

2.3 非洲菊的菌核病菌的分子鉴定

本研究扩增获得非洲菊菌核病菌jh-fzj-1的16S rDNA基因序列，得到1条大小约为589 bp的产物，将该序列与NCBI数据库中已知多个序列构建系统发育树，并以Botrytiscinereastrain strain QS-1(MN589850.1)为外组。结果(图2)表明，本研究分离获得的菌株jh-fzj-1与已发表的Sclerotiniasclerotiorum株系为同一个分枝，但相似率较低。因此，侵染非洲菊的菌核菌为Sclerotiniasclerotiorum(Lib.) de Bary，这与曹奕鸯[7]的结果一致。

2.4 非洲菊对菌核病的品种抗病性筛选

对21个非洲菊品种进行田间接种鉴定，接种5 d后部分非洲菊叶片可见明显病斑，随着时间的推移，病斑持续扩展，接种20 d后调查病害发生情况。如表1所示，不同非洲菊品种感染菌核病的病情指数差异显著，对菌核病抗性水平也不相同。其中高抗的品种为有3个，占鉴定材料的14.3%；抗病和中抗病品种分别为11和3个，分别占鉴定材料的52.4%和14.3%；感病和高感品种分别为3个和1个，分别占鉴定材料的14.3%和4.8%。其中常规种植品种基本为抗病，仅水粉为中抗；其中新引进的品种中，抗病及高抗病品种占比为62.5%，大大降低了非洲菊种植过程中菌核病的发病率。

3 讨论

菌核病是一种世界性分布的土传真菌性病害，其中核盘菌引起的菌核病就可危害约75 科278属408种植物。菌核病作为非洲菊生产栽培过程中发生最为严重的土传病害，整个生育期均可发病，并且条件适宜时发病迅猛，导致产区持续缺苗死苗。目前该病的防控主要以栽培管理、化学药剂防治和局部土壤消毒为主要技术手段，但由于土地资源的限制，轮作困难，菌核病的病害发生频繁。应用抗病品种是非洲菊菌核病防治中最经济有效的方法，而当前非洲菊的品种选育仍以花型、花色、株高、叶形等栽培指标为衡量标准，花卉的抗病性育种研究起步晚，相关的研究论文少，对非洲菊的抗性等级和评价指标研究尚属空白。本研究对浙江地区非洲菊菌核病的优势菌种进行了鉴定，确定了非洲菊菌核病的菌种为Sclerotiniasclerotiorum(Lib.) de Bary。同时也对市场上普遍种植和最新引进的共21个非洲菊品种进行了菌核病的抗性筛选，发现不同非洲菊品种对菌核病的抗性具有显著差异性。高抗或抗菌核病的非洲菊品种占66.7%以上，中抗及以下的非洲菊品种约占33.3%，常规种植品种和新引进的品种均以抗病品种为主，这为非洲菊菌核病的发生提供了较好的天然屏障。

图2 基于ITS 核苷酸序列非洲菊菌核病菌的系统发育树

表1 非洲菊品种对菌核病的抗性评价