特色芋艿病毒病检测及组培体系优化研究

马燕欣，郎淑平，袁晔，陈婕

(嘉兴市农业科学研究院，浙江 嘉兴 314016)

芋为天南星科芋属植物，是嘉兴市重要水生蔬菜种类之一[1]。生产上芋主要通过无性繁殖留种，长期的无性繁殖会使植株中病毒数量不断积累，造成病害严重、种性退化、品质变劣，从而使一些地方特色芋种质资源面临灭绝风险[2]。国内报道的侵染芋的病毒主要是芋花叶病毒(Dasheenmosaicvirus,DsMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)，其中DsMV分布最广，为害最大[3-4]。

组织培养技术已经广泛应用于芋的脱毒和提纯复壮[5]，组织培养过程中低污染率和高芋芽增殖系数是提高组培效率的关键。为了实现低污染率，除了优化外植体灭菌方法，还可以在培养基中针对性的加入抑菌剂，减少或防止真菌和细菌污染[6-7]。激素种类和使用浓度是影响组培苗增殖系数的主要因素，已有的研究认为，在芋茎尖组织培养过程中，一定浓度的TDZ可以增强外植体的活力，使侧芽增殖速率提高很多倍，且TDZ还存在诱导侧芽扁化等效应[2]。

本文以嘉兴地方特色红芽多子芋W1红为研究对象，调查检测田间植株DsMV发病情况，研究外植体消毒剂种类和消毒时间对芋茎尖初代培养的影响、抑菌剂种类和使用浓度对芋茎尖初代培养和继代培养的影响，并比较TDZ和6-BA对芋组织培养的影响，构建了嘉兴特色红芽多子芋的组培体系。

1 材料与方法

1.1 材料

嘉兴地方特色红芽多子芋W1红，DsMV病毒检测的引物参照王彦芬设计引物[4](上海生工生物技术有限公司合成，引物扩增片段313 bp)，反转录试剂盒购自美国Promega公司，PCR试剂盒购自日本Takara公司，苯甲酸钠购自天津市致远化学试剂有限公司，菌杀光购自桂林宏光生物科技有限公司，其他试剂均为国产或进口分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 芋病毒病田间发病情况调查

2021年4月10日，将红芽多子芋W1红种植于嘉兴市农业科学研究院古塘基地，试验田从未种植过芋艿；双行种植，行距60 cm，株距45 cm，共种植110株。8月20日进行芋病毒病调查，并将有病症的叶片取回进行RT-PCR检测。总RNA提取和RT-PCR方法参照王彦芬的方法[4]。

1.2.2 培养基配制

配制MS培养基。选择食品用防腐剂苯甲酸钠和混合抑菌剂菌杀光作为抑菌剂在芋茎尖培养中使用，将相应浓度的抑菌剂直接加入配好的培养基中混合均匀后分装，用瓶盖封口，调节pH值至5.8，121 ℃ 高压灭菌15 min。

1.2.3 外植体不同消毒方式对芋茎尖培养的影响

选取芽长3 cm左右的W1红芋头，流水冲洗2 h；剜割芋芽，流水冲洗20 min；剥去茎尖外表层2～3层，转移到超净工作台上用75%乙醇浸泡30 s，进行不同灭菌处理，后用无菌水漂洗5次；剥取3～5 mm茎尖组织接入1号培养基中，每瓶接种2个芋芽，每个处理接种10瓶。接种后7 d统计受污染芋茎尖数目和转绿数目，30 d统计茎尖周围萌发的侧芽数。试验重复3次。转绿率=未污染茎尖转绿数/未污染茎尖数；侧芽萌发系数=茎尖周围萌发侧芽总数/未污染茎尖转绿数。

1.2.4 不同激素或生长调节剂处理对芋茎尖组织培养的影响

将剥取的芋茎尖组织接种到4种培养基中(表3)，每种培养基接种10瓶，每瓶接种2个芋茎尖。分别于接种后45 d统计茎尖周围萌发的侧芽数和侧芽平均高度，试验重复3次，各重复间隔1周。

1.2.5 抑菌剂处理对芋组织培养的影响

将剥取的芋茎尖组织接种到添加不同抑菌剂的培养基中，接种后7、20、30 d分别统计材料转绿情况、污染情况和外植体生长情况。试验重复3次，各重复间隔1周。

1.2.6 组培条件

温度25 ℃，光照每天12 h，光强1 500 lx。

1.3 数据处理与分析

用Excel表格和DPS软件进行数据统计分析，用Duncan’s新复极差法进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 DsMV田间调查结果及RT-PCR结果

田间调查发现，芋花叶病毒发病普遍(图1)。将有病毒病症状的叶片进行RT-PCR(图2)。

A、B—叶片叶脉间发黄、花叶；C、D—叶片叶脉间褪绿、皱缩。图1 不同症状芋叶片

M—marker；1—CK；2～4—叶片具有皱缩褪绿症状的W1红植株。图2 芋花叶病毒RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳

表1表明，叶脉间褪绿、皱缩症状叶片的DsMV带毒率为100%，叶脉间发黄症状叶片的DsMV带毒率仅为8.51%。结果表明，叶脉间褪绿及皱缩症状为DsMV的典型症状，而叶脉间发黄的症状可能是由于缺乏营养素、虫害或者其他种类病害等造成。

表1 芋病毒病田间调查和RT-PCR结果

2.2 外植体不同消毒方式对芋茎尖初代培养的影响

对不同灭菌处理的芋茎尖组织培养过程中的污染率、转绿率和侧芽萌发系数等进行统计。表2表明，用有效氯含量为5%的次氯酸钠作为灭菌剂，灭菌25 min时，芋茎尖组织初代培养过程中污染率最低。

表2 不同消毒方式下芋茎尖组培转化增殖结果

用0.1%氯化汞作为灭菌剂，灭菌时长10 min，接种7 d污染率70.0%，随着灭菌时间增加，污染率降低，灭菌25 min污染率最低为6.67%，接种7 d后外植体转绿率显著降低。

2.3 不同激素处理对芋茎尖初代培养的影响

从表3、图3可以看出，使用不同激素对芋茎尖进行初代培养，不同处理侧芽萌发系数不同，培养基中添加0.01 mg·L-1TDZ的芋芽侧芽萌发系数最高，添加5.0 mg·L-16-BA的侧芽萌发系数最低；不同处理组培苗植株高度差异也大，培养基中添加2.0 mg·L-16-BA的组培苗平均株高最高，添加5.0 mg·L-16-BA的株高最矮，两者间差异极显著。添加TDZ激素的处理芋茎尖侧芽萌发系数高于6-BA；对于同种激素而言，使用浓度较低时更有利于茎尖组织扩增，且组培苗的生长更为健康。

表3 添加不同激素时芋茎尖组织培养结果

左中右分别为0.1 g·L-1苯甲酸钠、2.0 mg·mL-1 6-BA、0.01 mg·mL-1 TDZ。图3 芋茎尖组织接入不同培养基50 d的组培苗生长情况

2.4 不同抑菌剂对芋组织培养的影响

将灭菌处理的外植体接种于添加了抑菌剂的培养基中，试验结果见表4。在芋初代培养中，苯甲酸钠的抑菌效果最好，但添加苯甲酸钠的外植体不能正常转绿，说明苯甲酸钠不适合在芋初代培养中使用(图3中A)。2种浓度菌杀光处理抑菌效果与对照差异不大，转绿茎尖组织生长速度和萌发芋芽数显著低于对照。说明苯甲酸钠和菌杀光都不适合在芋初代培养中使用。

3 小结与讨论

长期无性繁殖使芋种带毒严重，对芋产量和品质都造成严重影响。调查清楚地方特色芋W1红病毒病发生情况，优化芋茎尖组培体系，为当地特色芋种质资源创新利用提供技术支撑。

表4 添加不同抑菌剂时芋茎尖组织培养结果

本研究调查了W1红田间病毒病发生情况，并用DsMV特异性分子标记引物对有病症的植株进行RT-PCR检测。结果表明，叶脉中间褪绿、皱缩可为DsMV特异性病症，叶脉中间发黄和芋病毒病之间的关系还需进一步研究。比较外植体不同消毒处理的污染率、转绿率和侧芽萌发系数，用有效氯含量5%的次氯酸钠消毒25 min，组培效率最高。比较6-BA和TDZ在芋茎尖组织培养过程中侧芽萌发系数和组培苗生长状况认为，相比TDZ，浓度为2.0 mg·L-1的6-BA更适合在红芽多子芋中使用；在芋茎尖组培过程中，培养基中激素浓度高时，在茎尖基部形成大量愈伤组织，只有很少的愈伤组织能分化成苗，且这些苗多具有丛生、扁平、叶片细小、表面粗糙等特点；适合在芋茎尖组织培养过程中使用的抑菌剂种类、使用浓度以及使用时期等内容还需进一步研究。

在试验过程中还观察到，不同季节进行芋茎尖组织培养操作时，茎尖组织侧芽萌发系数和生长状态存在差异，这可能与不同季节芋本身含有的激素物质有关，具体原因还需进一步分析。本文只统计分析了各处理条件下芋茎尖的污染率、转绿率、侧芽萌发系数和芋苗株高等数据，对芋苗鲜重、根系活力、移栽成活率和移栽后种球大小等数据没有进行研究，需要在后续研究中继续进行。