转基因玉米2HVB5的性状鉴定及遗传稳定性分析

李圣彦 李香银 李鹏程 张明俊 张杰 郎志宏

（1.中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081；2.中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193）

玉米是我国重要的食物、饲料和工业原料。随着人民生活水平不断提高，对玉米的需求量也不断增加。据统计，近20年来我国玉米种植面积和产量分别增长了170%和228%，成为我国第一大作物［1］。但在农业生产中虫害一直是影响玉米产量和品质的重要因素，我国玉米的主要害虫包括亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）、东方粘虫（Mythimna separate）、棉铃虫（Helicoverpa armigera）、草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）等。亚洲玉米螟俗称钻心虫，属鳞翅目螟蛾科，在我国各地均有发生，可危害玉米植株地上各个部分［2］。东方粘虫，属鳞翅目夜蛾科，低龄幼虫食量较小，高龄幼虫进入暴食阶段，可在短时间内将大面积作物叶片吃光，繁殖能力较强［3］。棉铃虫，属鳞翅目夜蛾科，多食性害虫，第4 代棉铃虫主要危害玉米雌穗，严重影响雌穗和籽粒生长［4］。草地贪夜蛾，属鳞翅目夜蛾科，2019年入侵我国云南，因其适生区域广、寄主范围宽、增殖潜能强、扩散速度快等特点，已经成为一种严重威胁玉米生产的害虫［5］。

随着生物技术的发展，Bt 作物的应用为害虫防治开辟了新的途径。自1996年第一例转基因玉米Bt176 商业化以来，转基因玉米在全球得到广泛应用，取得了十分显著的经济、社会和生态效益［6］。国外转基因玉米研究起步较早，发展十分迅速，目前商业化种植的抗虫转基因玉米主要有转cry1Ab基因的MON810、Bt11，转cry1Fa2基因的TC1507，转cry2Ab2和cry1A.105基因的MON89034，转vip3Aa20基因的MIR162 等，耐除草剂转基因玉米主要有转cp4-epsps基因的NK603，转mepsps基因的GA21等［6］。我国一直高度重视作物转基因技术的研究，已经培育出一批转基因玉米新品系。2019-2021年农业农村部相继批准了转cry1Ab和epsps基因的抗虫耐除草剂玉米DBN9936，转cry1Ab/cry2Aj和g10evoepsps基因的抗虫耐除草剂玉米瑞丰125，转epsps和pat基因的耐除草剂玉米DBN9858，转vip3Aa19和pat基因的抗虫耐除草剂玉米DBN9501，转mcry1Ab和mcry2Ab基因的抗虫玉米ND207，转cry1Ab和cry2Ab基因的抗虫玉米瑞丰8 以及抗虫耐除草剂玉米DBN3601T（DBN9936×DBN9501）的安全证书，标志着国产转基因玉米即将进入产业化应用。

Btcry2Ah基因是国内研究团队通过宏基因组方法克隆出的一种新的Bt 杀虫蛋白基因，Cry2Ah 蛋白对玉米螟、棉铃虫和Cry1Ac 抗性棉铃虫有抑制活性［7］，并且与Cry1Ac、Cry1Ab 无交互抗性［8］。前期研究中，通过基因突变获得了Cry2Ah 的两个突变体Cry2Ah-vp（V354VP）和Cry2Ah-sp（V354SP），在烟草中分别表达cry2Ah及cry2Ah-vp、cry2Ah-sp基因，结果表明与Cry2Ah 相比，突变体Cry2Ah-vp 和Cry2Ah-sp 对棉铃虫和抗性棉铃虫具有更高的杀虫活性［9］。随后分别将cry2Ah-vp/bar和cry2Ah-sp/bar基因转入玉米中，通过抗虫性筛选得到一个含cry2Ahvp/bar基因高抗东方粘虫的转基因玉米事件VP1-5（即2HVB5），为抗虫耐除草剂玉米的培育提供了种质资源［10］。

在本研究中对已回交转育至骨干自交系郑58的BC5S1、BC5S2代2HVB5 材料进行Southern blot、ELISA、抗虫性（东方粘虫、棉铃虫和草地贪夜蛾）、草铵膦耐受性检测以及农艺性状调查，分析2HVB5材料的遗传稳定性和目标性状功能效率，为抗虫耐除草剂转基因玉米2HVB5 的产业化应用提供理论基础和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 玉米材料 玉米自交系郑58（简称Z58）和回交转育郑58 的BC5S1、BC5S2代转基因玉米2HVB5 材料，以上材料均由中国农业科学院生物技术研究所郎志宏实验室保存。

1.1.2 供试昆虫 东方粘虫、棉铃虫、草地贪夜蛾虫卵均购自美延（北京）农业科技有限责任公司，虫卵置于人工培养箱（28℃）孵化。所有初孵幼虫作为供试虫源进行生物活性测定。

1.2 方法

1.2.1 Southern blot 检测 分别提取BC5S1、BC5S2代2HVB5 转基因玉米和对照材料郑58 自交系的叶片基因组DNA，2HVB5 基因组DNA 分别用Hind III 和SacI 酶切，对照郑58 基因组DNA 用Hind III 酶切，37℃酶切完全后将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳并转膜。cry2Ah-vp基因探针（正向引物：5'-GAGTGGATGGAGTGGAAG-3'，反向引物：5'-CGATGTTTGGGAAGGTCT-3'）和bar基因探针（正向引物：5'-GACGCACAATCCCACTATCCT-3'，反向引物：5'-CAGCGACCACGCTCTTGAAGC-3'） 按照PCR DIG Probe Synthesis Kit 说明书进行制备。Southern blot 检测按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II 说明书进行操作。利用超灵敏多功能成像仪对DNA 杂交信号进行图像分析。

1.2.2 ELISA 检测 选取BC5S1、BC5S2代2HVB5 转基因玉米和对照材料郑58 苗期（V1）的根、叶，拔节期（V6）的根、茎、叶，吐丝期（R1）的根、茎、叶、花粉、雄穗、花丝、雌穗，完熟期（R6）的根、茎、叶、籽粒共4 个时期16 个部位的组织材料进行总蛋白的提取（3 次生物学重复）。选用Envirologix Quantiplate Kit for Cry2A（Catalog Number AP 005）检测Cry2Ah 蛋白的表达量及Envirologix Quantiplate Kit for PAT/bar（Catalog Number AP 013）检测PAT 蛋白的表达量。操作步骤按照相应试剂盒的说明书进行。使用多功能酶标仪FlexStation3（450 nm 检测波长，630 nm 参考波长）测定样品OD 值，根据标准曲线计算Cry2Ah-vp 和PAT 蛋白的表达量。

1.2.3 室内生物活性测定 东方粘虫和草地贪夜蛾的室内生测分别参照王振营等［11］和武奉慈等［12］的方法，取玉米V6 时期心叶剪成1 cm2左右的小片，放入24 孔细胞培养板中，每孔接1 头初孵幼虫，3次生物学重复，接虫48 h 后每天统计1 次存活幼虫数，连续统计至7 d。棉铃虫室内生测参照常雪艳等［13］的方法，取玉米吐丝期的花丝和雌穗分别剪成小段，放入12 孔细胞培养板中，每孔接1 头棉铃虫初孵幼虫，3 次生物学重复，接虫48 h 后每天统计1 次存活幼虫数，连续统计至7 d。每天统计结果时根据玉米材料的取食和新鲜程度及时更换新的材料。

1.2.4 田间生物活性测定 依据《转基因植物及其产品环境安全检测 抗虫玉米 第1 部分：抗虫性》（农业部953 号公告-10.1-2007）进行2HVB5 转基因玉米对东方粘虫和棉铃虫的田间抗虫性检测。在玉米V6 期进行东方粘虫的接虫，接虫20 d 后调查叶片为害程度并判定2HVB5 对东方粘虫的抗性水平。在玉米吐丝期进行棉铃虫的接虫，接虫20 d 后调查雌穗为害程度并判定2HVB5 转基因玉米穗期对棉铃虫的抗性水平。每小区人工接虫不少于40 株。

1.2.5 草铵膦耐受性检测 依据《转基因植物及其产品环境安全检测 抗除草剂玉米 第1 部分：除草剂耐受性》（农业部953 号公告-11.1-2007）对2HVB5转基因玉米的田间目标除草剂（草铵膦）耐受性进行检测。草铵膦除草剂施用量分别为农药登记标签中剂量的1 倍（600 g/hm2）、2 倍（1 200 g/hm2）、4倍（2 400 g/hm2）。按推荐时间施用。分别在用药1、2、4 周调查和记录成苗率、植株高度、药害症状。药害症状分级按GB/T 19780.42 执行。

1.2.6 农艺性状调查 每个材料随机选取30 株，吐丝后测量株高、穗位高。收获后进行考种，测量穗长、穗粗、秃尖长、穗行数、行粒数、千粒重及单株产量。

1.2.7 数据分析 利用Excel 软件进行数据整理，用SAS 9.4 数据处理软件进行数据分析，差异显著性比较均采用成组法t检验。

2 结果

2.1 转基因玉米2HVB5的Southern blot分析

Southern blot 检测了连续两代（BC5S1、BC5S2）转基因玉米2HVB5 的外源基因插入情况，结果（图1）显示，2HVB5 基因组DNA 在Hind III 和SacI 酶切后以目的基因cry2Ah-vp和bar为探针都只检测到一条杂交条带，且两代之间条带大小没有差别，对照郑58 未检测到杂交信号。这表明2HVB5 中目的基因cry2Ah-vp和bar都是以单拷贝的形式整合到玉米基因组并稳定遗传。

图1 BC5S1、BC5S2 代转基因玉米2HVB5 中目的基因的Southern blot 检测Fig.1 Southern blot analysis of the target genes in the BC5S1 and BC5S2 generation of transgenic maize 2HVB5

2.2 转基因玉米2HVB5中目的蛋白的定量分析

ELISA 检测结果（图2）显示，转基因玉米2HVB5 的不同时期、不同组织部位的目的蛋白Cry2Ah-vp 和PAT 均有表达，不同代别之间差异不显著，而对照材料郑58 未检测到目的蛋白。除花粉外，Cry2Ah-vp 和PAT 蛋白在2HVB5 不同时期的叶片中表达量相对较高，BC5S1代叶片中Cry2Ah-vp 和PAT 蛋白表达量分别在2.38-3.29 μg/g FW（鲜重）和8.24-16.85 μg/g FW（鲜重）之间；BC5S2代叶片中Cry2Ah-vp 和PAT 蛋白表达量分别在2.24-3.31 μg/g FW（鲜重）和11.49 -16.46 μg/g FW（鲜重）之间。

图2 BC5S1、BC5S2 代转基因玉米2HVB5 中目的蛋白表达量分析Fig.2 Expression analysis of target proteins in the BC5S1 and BC5S2 generation of transgenic maize 2HVB5

2.3 转基因玉米2HVB5的抗虫性分析

室内生物活性检测结果（图3）显示，BC5S1、BC5S2代转基因玉米2HVB5 心叶接东方粘虫初孵幼虫2 d 后，幼虫校正死亡率分别为50.42%和57.83%；3 d 后幼虫校正死亡率分别为95.65%和97.03%；4 d 后东方粘虫幼虫全部死亡。BC5S1、BC5S2代转基因玉米2HVB5 雌穗接棉铃虫初孵幼虫2 d 后，幼虫校正死亡率分别为50.42%和54.17%；3 d 后幼虫校正死亡率分别为70.83%和83.33%；4 d 后幼虫校正死亡率分别为96.65%和91.67%；5 d后棉铃虫幼虫全部死亡。BC5S1、BC5S2代转基因玉米2HVB5 花丝接棉铃虫初孵幼虫2 d 后，幼虫校正死亡率分别为50.76%和56.25%；3 d 后幼虫校正死亡率分别为88.64%和83.75%；4 d 后棉铃虫幼虫全部死亡（图3-a）。2HVB5 的叶片、雌穗和花丝只受到轻微损伤，而对照材料郑58 取食严重，两者对比差异显著（图3-b）。BC5S1、BC5S2代转基因玉米2HVB5 心叶接草地贪夜蛾初孵幼虫3 d 后，幼虫有死亡，7 d 后草地贪夜蛾幼虫校正死亡率分别为25.08%和20.83%（图4-a）；但与对照Z58 相比，转基因玉米2HVB5 对草地贪夜蛾幼虫有明显的体重抑制，饲喂BC5S1、BC5S2代转基因玉米2HVB5 的草地贪夜蛾幼虫体重分别下降71.36%和80.83%（图4-b），幼虫活力下降不能进一步完成生长发育。室内生物活性检测结果表明，转基因玉米2HVB5 对亚洲玉米螟、东方粘虫和棉铃虫的抗性水平均达到“高抗”，对草地贪夜蛾具有显著的生长抑制作用。

图3 BC5S1、BC5S2 代转基因玉米2HVB5 的东方粘虫和棉铃虫室内生物活性检测结果Fig.3 AW and CB bioassay results of BC5S1 and BC5S2 generation transgenic maize 2HVB5 in laboratory

图4 BC5S1、BC5S2 代转基因玉米2HVB5 的草地贪夜蛾室内生物活性检测结果Fig.4 FAW bioassay results of BC5S1 and BC5S2 generation transgenic maize 2HVB5 in laboratory

田间生物活性检测结果显示，根据《转基因植物及其产品环境安全检测 抗虫玉米 第1 部分：抗虫性》（农业部953 号公告-10.1-2007）中玉米叶片受粘虫为害程度的分级标准，BC5S1、BC5S2代转基因玉米2HVB5的V6期东方粘虫的食叶级别分别为1.19和1.29，而对照材料郑58 的V6 期东方粘虫食叶级别分别为7.10 和7.05，两者差异极显著。根据《转基因植物及其产品环境安全检测 抗虫玉米 第1 部分：抗虫性》（农业部953 号公告-10.1-2007）中玉米对粘虫的抗性评价标准，2HVB5 转基因玉米对东方粘虫的抗性级别为“高抗”，对照郑58 对东方粘虫的抗性级别为“感”（表1）。根据《转基因植物及其产品环境安全检测 抗虫玉米 第1 部分：抗虫性》（农业部953 号公告-10.1-2007）中玉米雌穗受棉铃虫为害程度的分级标准，BC5S1、BC5S2代转基因玉米2HVB5 的吐丝期棉铃虫的食穗级别分别为0.60和0.73，而对照材料郑58 的吐丝期棉铃虫的食穗级别分别为3.20 和3.97，两者差异极显著。根据《转基因植物及其产品环境安全检测 抗虫玉米 第1 部分：抗虫性》（农业部953 号公告-10.1-2007）中玉米雌穗对棉铃虫的抗性评价标准，2HVB5 转基因玉米对棉铃虫的抗性级别为“高抗”，对照郑58 对棉铃虫的抗性级别为“中抗”（表2）。田间生物活性检测结果表明，转基因玉米2HVB5 对东方粘虫和棉铃虫的抗性水平均达到“高抗”，与室内生物活性检测结果一致。

表1 心叶期东方粘虫食叶级别Table 1 Leaf damage grades of AW at whorl stage

表2 吐丝期棉铃虫食穗级别Table 2 Ear damage grades of CB at silking stage

2.4 转基因玉米2HVB5的草铵膦耐受性分析

草铵膦耐受性检测结果显示BC5S1、BC5S2代转基因玉米2HVB5 在中剂量1 倍（600 g/hm2）、中剂量2 倍（1 200 g/hm2）和中剂量4 倍（2 400 g/hm2）的草铵膦处理后均未出现受害症状，对照郑58 则全部死亡；转基因玉米2HVB5 在不同处理、不同时间的株高与郑58 相比无显著差异，单株产量与郑58相比无显著差异（表3），这表明转基因玉米2HVB5能够抗中剂量4 倍及以下浓度的草铵膦，可以满足生产应用的需要。

2.5 转基因玉米2HVB5的农艺性状调查

转基因玉米2HVB5 连续两代的农艺性状调查结果（表4）显示，在同一世代中转基因玉米2HVB5在未喷施草铵膦和喷施田间使用中剂量1 倍（600 g/hm2）、中剂量2 倍（1 200 g/hm2）和中剂量4 倍（2 400 g/hm2）的草铵膦后的主要农艺性状与郑58相比无显著差异，转基因玉米2HVB5 因含有抗虫和耐除草剂基因具有抗虫和草铵膦耐受性之外，其他农艺性状与对照玉米郑58 无显著差异，回交的高代材料在农艺性状方面趋于稳定，与回交受体相同，可用于后续的育种。

3 讨论

在玉米的遗传转化中，农杆菌介导法以其费用低、拷贝数低、重复性好、较完整的转化大片段等优点，被广泛使用。但农杆菌介导的T-DNA 插入是随机整合到植物的染色体中［14-15］，这种插入位置的不确定性，可能会造成外源或内源基因的缺失或沉默，导致转基因植物无目的性状或农艺性状发生改变［16］。T-DNA 序列的整合位点因受体植物不同具有一定差异，并且转入的外源基因整合是否具有稳定性，整合的位置以及边界序列的状态等都难以控制。因此对比研究不同世代转基因作物的外源基因DNA整合、蛋白表达、目的性状以及农艺性状等遗传稳定性，对转基因作物的商业化应用具有非常重要的意义。在本研究中对连续5 代回交郑58 并自交1 代和2 代（BC5S1、BC5S2）的转基因玉米2HVB5 材料的检测结果显示，外源目的基因稳定地整合到玉米基因组中，目的基因的拷贝数、蛋白表达量、抗虫性、草铵膦耐受性以及农艺性状等在不同代别中无显著差异，并且转基因玉米2HVB5 高抗东方粘虫、棉铃虫，能够耐受田间使用中剂量4 倍的草铵膦。这些结果都证明转基因玉米2HVB5 是一个高抗虫耐除草剂并且遗传稳定的转基因材料，具有较好的产业化应用前景。

Bt 作物的应用为害虫防治开辟了新的途径。但从生物进化角度来看，长期种植单一的Bt 作物防治靶标害虫将不可避免地引发害虫的抗性。近些年已经有靶标害虫在田间对Bt 作物产生抗性的相关报道。美国东部发现对Cry1Ac 棉花产生抗性的美洲棉铃虫［17］，南非发现对Cry1Ab 玉米产生抗性的非洲二化螟［18］，波多黎各发现对Cry1F 玉米产生抗性的草地贪夜蛾种群［19］，巴西也发现对Cry1Ab 玉米产生抗性的草地贪夜蛾种群［20］。国内也监测到田间棉铃虫对Cry1Ac 的抗性水平呈明显上升的趋势［21］。这将影响Bt 作物的可持续应用。针对害虫产生抗性风险的问题，“多基因叠加”策略是目前应用最为广泛的抗性治理策略［22-23］。商业化的转基因玉米中主要是通过杂交组合的方式叠加不同的Bt 基因扩大杀虫谱并延缓害虫抗性的产生。已有的研究表明Cry1Ab/1Ac 与Cry2Ab 间存在不对称的交互抗性［8，24］，而ABCC2 受体可能是导致产生交互抗性的主要原因［25］。cry2Ah基因是具有自主知识产权的新型杀虫基因，与cry2Ab基因（GenBank：DQ361266.1）核苷酸序列相似性为94.47%，氨基酸序列相似性为93.20%。尽管cry2Ah基因与cry2Ab基因序列相似性较高，但研究表明Cry2Ah 与Cry1Ab/1Ac 不存在交互抗性［8］，与Cry2Ab 相比，Cry2Ah 可能更适合与Cry1A 类和Vip3Aa 进行组合抗虫。在本研究中，表达Cry2Ah-vp 蛋白的转基因玉米2HVB5 对东方粘虫和棉铃虫高抗，对草地贪夜蛾有明显的体重抑制。后续将转基因玉米2HVB5 与本课题组培育的转cry1Ah基因抗虫玉米HGK60、转vip3Aa11/cp4-epsps基因抗虫耐除草剂玉米VP3C1 进行杂交（未发表数据），培育多基因叠加的具有自主知识产权的抗虫耐除草剂玉米，可有效增强对靶标害虫的杀虫效果并延缓害虫抗性的产生。

表3BC5S1、BC5S2 代转基因玉米2HVB5 草铵膦处理后的结果Table 3 Results of BC5S1 and BC5S2 generation transgenic maize 2HVB5 after glufosinate application量2.32a 2.62a 2.68a 2.45a 2.56a 2.95a 2.89a产2.70a株Damagepercent/%单Yield perplant/g 106.7±105.7±0106.6±0105±0106.7±106.4±106.6±0105.15±2.16a 0106.5±0106.45±2.5a 0100 4 周4 weeks 00100 0100 000100 0100 0100 0 2 周2 weeks 00100 000100 0100 0100 0100 0100 0率受1 周1 week害00 0100 100 0100 000100 0100 0100 0 1.5a 2.14a 2.48a 2.05a 1.62a 4 周4 weeks 113.45±1.47a 113.6±0113.15±1.95a 0112.5±0113.5±112.45±1.7a 112.55±2.04a 0112.7±0112.1±0112.95±1.54a 2 周2 weeks 1.47a 54.95±55.7±1.34a 1.19a 1.43a 055±1.56a Plant height/cm 055±1.65a 1.76a 53.1±1.62a 055.05±53.95±053±1.62a 053.5±1.54a 053.45±度1.14a 0.99a 1.32a 1.07a 1.39a 1.35a植1 周1 week株46.3±1.38a高46.65±046.5±1.15a 046.35±047.1±1.07a 46.05±45.25±046±1.21a 045.85±045.65±4 周4 weeks 100 Plantingpercent/%100 0100 0100 0100 100 100 0100 0100 0100 2 周2 weeks 100 100 0100 0100 0100 100 100 0100 0100 0100成1 周1 week率苗100 100 0100 0100 0100 100 100 0100 0100 0100草Glufosinate理处膦铵treatment/（g·hm-2）0 600 1 200 2 400 0 600 1 200 2 400材Samples料Z58 2HVB5 Z58 2HVB5 Z58 2HVB5 Z58 2HVB5 Z58 2HVB5 Z58 2HVB5 Z58 2HVB5 Z58 2HVB5代Generation别BC5S1 BC5S2

单Yield perplant/g量2.32a 2.62a 2.68a 2.56a 2.95a产2.7a株106.7±105.7±106.6±105±106.4±106.6±105.15±2.16a 106.45±2.5a千1 000-grain 3.77a 2.55a 3.66a 2.92a 2.93a 3.25a重粒weight/g 280.6±279.55±3.2a 280.1±280.8±279.35±3.41a106.7±2.45a 279.9±280.4±278.55±2.5a 279.25±3.51a106.5±2.89a 280.3±28.1±0.72a 0.75a行Kernels perrow 0.86a 28.3±0.86a 0.79a 0.85a数0.66a粒0.83a 28.3±28.25±27.85±0.83a 28.1±28.1±0.79a 28.25±性0.91a 13.75±穗Rowsperear行0.79a 27.95±0.83a 13.9±0.85a数状艺0.81a 28±13.85±14.1±0.79a 14.05±14±0.79a 14.05±14±0.86a 13.7±0.8a 14.1±0.85a农2HVB5 的秃Baretip长尖length/cm 0 0 0 0 0 00 0 0 0米玉因0.16a 0.14a基粗转穗Ear diameter /cm 4.07±0.1a 4.1±4.12±0.16a 4.1±4.12±0.15a 4.08±0.12a 4.09±0.14a 4.13±0.19a 4.13±0.16a 4.11±0.14a BC5S2 代1.17a 1.27a 1.1a 0.79a 0.92a 4 BC5S1、穗Ear length/cm Table 4Agronomictraits of BC5S1 andBC5S2 generation transgenic maize2HVB5长2.23a 16.55±1.15a 16.65±16.5±1.43a 16.55±1.96a 16.55±1.15a 16.25±2.06a 16.25±1.16a穗Ear height/cm 139.65±2.13a32.25±2.24a16.1±2.11a 16.45±1.1a 2.22a 16.3±1.66a高1.82a 32.05±2.07a 1.84a表位32.15±33.15±32.65±32.25±株Plant height/cm 1.93a 2.63a 1.61a 1.94a 1.79a高139.4±139.65±2.46a32.3±139.9±139.95±2.46a32.3±141.45±1.85a32.4±142.5±141.8±141.55±2.01a33.1±141.4±草Glufosinate理处膦铵treatment/（g·hm-2）0郑2HVB5 0 2HVB5 0 2HVB5 600 2HVB5 1200 2HVB5 2400 0材Sample料58 58郑2HVB5 600 2HVB5 1200 2HVB5 2400代Generation别BC5S1 BC5S2

转基因作物商业化以来，由于其显著的经济、社会和生态效益，使其在全球得到了广泛应用，截至2019年，全球共有71 个国家采用了转基因作物，其中29 个国家批准种植，42 个国家（包含欧盟26国）批准进口转基因作物用于食品、饲料和加工［6］。目前商业化转基因玉米的目标性状主要集中在抗虫、耐除草剂上，其中抗虫耐除草剂复合性状占复合性状转化体总数的96%。从现有商业化玉米转化体数量上来看，单性状商业化转化体数量长期处于较低水平，随时间变化波动平稳；而复合性状的商业化转化体数量随时间变化呈现持续升高后又降低的趋势，其中2007-2015年为复合性状商业化转化体数量增长最快的阶段［26］。从玉米产业来看，复合性状转基因玉米符合生产发展要求，并且抗虫和耐除草剂仍然是复合性状转基因玉米的主要目标性状。因此抗虫耐除草剂玉米仍然是转基因玉米发展的主要方向。在全球除草剂市场上，氨基酸类除草剂（包括草甘膦、草铵膦、双丙氨膦）的市场规模最大。2019年全球除草剂市场规模为263.31 亿美元，其中氨基酸类除草剂占比约23.6%［27］。2020年全球草铵膦市场规模达到10.5 亿美元，仅次于草甘膦位列所有除草剂品种的第二位，近6年的复合增长率为6.3%，是增长最快的非选择性除草剂，市场开发潜力和应用前景巨大［27］。转基因玉米2HVB5 表达cry2Ah-vp和bar基因，在抗虫的同时也赋予了玉米耐草铵膦的特性。本研究结果表明，转基因玉米2HVB5 对草铵膦除草剂具有高的耐受性，田间能够耐受中剂量4 倍的草铵膦，农艺性状与对照相比无显著差异，达到了生产用抗除草剂玉米对除草剂的耐受性水平。与抗虫耐草甘膦玉米HGK60 和VP3C1杂交后可同时抗草甘膦和草铵膦除草剂，具有更加广泛的生产应用前景。

4 结论

转基因玉米2HVB5 的外源基因以单拷贝形式整合到玉米基因组中并稳定遗传，目的蛋白Cry2Ahvp 和PAT 在植株的不同时期、不同组织部位均有表达，其中在叶片中的表达量相对较高，分别达到2-3.5 μg/g FW（鲜重）和8-17 μg/g FW（鲜重）。转基因玉米2HVB5 对东方粘虫和棉铃虫高抗，对草地贪夜蛾有明显的体重抑制，可有效防治玉米害虫尤其是夜蛾科害虫。2HVB5 转基因玉米可耐受田间使用中剂量4 倍量的草铵膦，农艺性状与对照郑58 相比无显著差异。