硅基pH荧光纳米颗粒的制备及其光学性能研究*

张 静，刘秀军，2，薛文博，王帅达

(1. 天津工业大学 化学工程与技术学院，天津 300387； 2. 天津工业大学 中空纤维膜材料与膜过程国家重点实验室，天津 300387)

0 引 言

检测土壤[1]、污水[2]、食品[3-4]、药物[5-6]的pH值对工业、农业等方面具有重要的意义。传统方法无法对细胞内部等特殊环境的pH值进行检测。pH荧光探针具有灵敏度高、响应时间快以及连续动态监测等优点[7]，在化学传感和生物探针等方面具有潜在的应用价值，如细胞内pH值检测[8-12]。

荧光素具有优良的生物相容性、摩尔吸收率和荧光量子场强，是生物化学研究中最常见的荧光团之一[13]。将荧光素钠和二氧化硅复合，荧光素钠分子内运动受到刚性无机材料的限制，阻塞非辐射弛豫通道，使放射性衰变填充到基态，从而提高染料的发光性能。例如Wang等[14]，将改性罗丹明B探针和荧光素异硫氰酸酯分别封装在通过Pickering乳液制备的Janus微球中，这种Janus纳米颗粒探针具有良好的线性(pH值为4～6)、高的光稳定性、良好的可逆性和低的细胞毒性。Janus纳米粒子探针的pKa值为6.86，在538和590 nm处的荧光强度与pH值有明显的变化，可以用于对正常细胞和癌细胞的定量测量。

本文首先将荧光素钠通过稳定的羧基键共价连接到N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷(KH792)上形成成荧光素钠/KH792共轭体系，再利用stöber法将荧光素钠/KH792与正硅酸乙酯分解出的二氧化硅复合制备羧基修饰的荧光纳米颗粒，对荧光纳米颗粒的pH光学响应进行研究。

1 实 验

1.1 试剂与仪器

荧光素钠，天津市大茂化学试剂厂，分析纯；盐酸，永飞化学试剂有限公司，分析纯；N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷(KH792)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，阿拉丁试剂有限公司，分析纯；乙醚、乙醇、正硅酸乙酯(TEOS)、氨水，天津艾利安电子科技有限公司，分析纯。

扫描电子显微镜(JSM-7610F型)，日本电子株式会社；Zeta电位和粒度分析仪(ZetaPALS型)，美国布鲁克海文仪器公司；荧光分光光度计(F-7000型)，日本日立公司；傅里叶变换红外光谱仪(NicoletiS50型)，美国里高尼公司；紫外-可见吸收分光光度计(U-3900/3900H型)，日本日立公司；高速离心机(TG16-WS型)，上海川一实验仪器有限公司。

1.2 荧光共轭体系的制备

将荧光素钠(1 mL，1×10-3mol/L)加入到盐酸溶液(1 mL，3 mol/L)中，使其混合充分，酸化0.5 h以上。将酸化后的荧光素钠加入到含有KH792(2 mL)的DMF溶液中，在干燥的氮气气氛下磁力搅拌12 h，并用薄层色谱(TLC)，直到纯荧光分子的斑点完全消失。最后，将未反应的KH792通过乙醚稀释分离出来，生成游离粉末。

1.3 荧光纳米颗粒的制备

采用stöber的方法合成羧基修饰的荧光纳米颗粒，在三口烧瓶里边加入100 mL乙醇、TEOS(100 μL)、20 mL水和2 mL荧光素钠/KH792共轭体系，搅拌均匀，再加入NH3·H2O(60 μL)，40 ℃下反应12 h。最后，6 000 r/min离心10 min，将荧光纳米颗粒从反应混合物中分离出来，用乙醇和水各洗涤2次。

1.4 荧光纳米颗粒的光学响应测试

用NaOH和HCl溶液调节出不同pH值的溶液，取50 μL荧光纳米颗粒(1×10-5mol/L)溶液，加入到3 mL不同pH值的溶剂中，等待5 min，充分混合，用于紫外吸收和荧光发射光谱的测定。

2 结果与讨论

2.1 荧光纳米颗粒的表征

利用粒度分析仪和扫描电子显微镜(SEM)对荧光纳米颗粒的大小及形貌进行分析。如图1所示，荧光纳米颗粒的平均粒径为150 nm左右，且荧光纳米颗粒的形状接近于球状，大小均匀。

图1 荧光纳米颗粒的(a)粒度分析结果；(b)扫描电镜图Fig.1 (a) Particle size distribution of fluorescent nanoparticles; (b) SEM images of fluorescent nanoparticles

利用傅里叶变换红外光谱(FTIR)对荧光纳米颗粒进行分析，如图2所示。与纯二氧化硅相比，将荧光分子负载到二氧化硅形成的荧光纳米颗粒的红外光谱在1 640 cm-1处出现了一个新的峰，这是由于荧光纳米颗粒表面C=O键的拉伸振动，1 400 cm-1为苯环共轭体系的伸缩振动，3 500～3 050 cm-1对应伯胺的不对称和对称伸缩振动。表明荧光纳米颗粒表面改性羧基的存在，二氧化硅与荧光素钠有效复合。

图2 SiO2和荧光纳米颗粒的红外光谱Fig.2 Infrared spectra of SiO2 and fluorescent nanoparticles

2.2 荧光纳米颗粒在不同pH的紫外吸收光谱

荧光纳米颗粒对pH值的不同响应特性，如图3(a)所示。pH值在1～3范围内，随着pH值的增加，430 nm处的吸收强度由1.4降低到0.4。pH值在5～11范围内，随着pH值的增加，吸收带从424 nm逐渐移到484 nm，吸光强度也逐渐增加，这是由于内酯部分在强碱性条件下水解，水解产物促使吸收强度增强了。然而当pH值大于11后，吸收强度变化趋缓。当溶液pH值从5到11时，在485 nm处吸收强度与pH具有良好线性关系，如图3(b)所示。

图3 (a)荧光纳米颗粒在不同pH条件下的紫外吸收光谱；(b)荧光纳米颗粒在485 nm处的紫外吸收强度与pH的关系Fig.3 (a) UV absorption spectra of fluorescent nanoparticles at different pH; (b) relationship between UV absorption intensity of fluorescent nanoparticles at 485 nm and pH

2.3 荧光纳米颗粒在不同pH的荧光光谱

如图4所示，随着pH值逐渐升高，纳米材料在520 nm处的荧光强度也逐渐增加，这是由于荧光纳米颗粒对pH值具有很高的敏感性。当pH值从4增加到5时，纳米材料的荧光强度增长较为缓慢，而pH值从5上升到7时，荧光强度迅速增加，等到pH值大于7以后，荧光强度增长再次趋于缓慢。

图4 (a)不同pH(pH=4，5，6，7，8，9)条件下荧光纳米颗粒的荧光光谱；(b)520 nm处的荧光强度与pH关系图Fig.4 (a) Fluorescence spectra of fluorescent nanoparticles at different pH (pH= 4,5,6,7,8,9); (b) the relationship between fluorescence intensity and pH at 520 nm

因为荧光纳米颗粒表面存在羟基，而溶液的pH值会影响羧基的质子化状态[15]，从而影响纳米颗粒在溶液中的稳定性。在碱性条件下，荧光纳米颗粒所携带的羧基被去质子化，并在纳米颗粒表面形成一个带负电荷的壳层，这种效应可以通过纳米颗粒之间的静电斥力保持溶液的稳定性。因此，在碱性条件下荧光强度高。在酸性条件下，羧酸基团质子化，纳米颗粒之间的静电斥力降低，形成聚集，荧光强度随之降低[16]。

如图5所示为荧光纳米颗粒和荧光素钠在520 nm处荧光强度折线图比较，不同pH值下荧光纳米颗粒的荧光强度明显高于荧光素钠，在中性条件下复合材料对pH值的变化更为敏感，荧光纳米颗粒具有可水解内酯结构基团，对pH敏感性能的变化可能是由于内酯水解造成的。

图5 荧光纳米颗粒和荧光素钠在522 nm处荧光强度与pH关系对比图Fig.5 Relationship between pH and fluorescence intensity of fluorescent nanoparticles and sodium fluorescein at 522 nm

2.4 抗干扰和稳定性测试

图6 (a)荧光纳米颗粒在pH为5(竖线填充)和pH为10(无填充)的水溶液中分别存在不同离子时的荧光响应。0-空白组，在pH=5和pH=10条件下，荧光纳米颗粒的荧光强度与时间关系图Fig.6 (a) Fluorescence response of fluorescent nanoparticles in the presence of different ions in aqueous solutions at pH 5 (vertical line filling) and pH 10 (no filling). 0-blank group, 1-K+, 2-Mg2+, 3-Na+, 4-Cl-, (b) relationship between fluorescence intensity and time of fluorescent nanoparticles at pH=5 and pH=10

3 结论

结合pH探针的特点和聚集诱导淬灭分子的作用机理，将荧光素钠与二氧化硅以硅烷偶联剂的方式结合到一起，制备了pH响应荧光纳米颗粒。对荧光纳米颗粒的pH响应进行了研究，在pH值为1～3时，紫外吸收强度随pH增加逐渐降低，在pH值为5～11时，紫外吸光强度随pH增加逐渐增加；且在pH值为4～9之间，荧光强度与pH值之间具有较好的响应关系。pH值为5和10的缓冲溶液中，荧光纳米颗粒对pH值的响应几乎不受其他离子的影响。因此，该材料可望在化学传感器和生物探针等方面得以应用。