针刀干预对膝骨关节炎兔软骨血管分布及CD34、CD105、VEGF表达的影响*

张 典 张 茜 许 悦 陈烯琳 秦露雪 郭长青

（北京中医药大学，北京 100029）

膝关节骨性关节炎（KOA）是在生物力学和生物学两者的共同因素相互影响状态下，引起膝关节周围结构异常变化和功能慢性退行性改变的骨关节疾病［1］，以疼痛、活动受限为主要临床表现，以关节软骨退变为最具标志性病变。正常的关节软骨不仅无血供来源，且长期处于生理性低氧环境中，KOA发病过程中的软骨细胞表现为病理性缺氧，且随着KOA病程进展，软骨细胞代偿性启动血管生成反而加速软骨退变。最新研究［2］表明，关节软骨退变及骨关节炎临床症状的严重程度可由软骨血管化程度反映出来。OA病程早期可见源于软骨下骨的微血管异常生成，侵入钙化层软骨，并可能随着OA病程继续发展，骨与软骨交界处新生血管密度进一步增加［3］，逐步突破潮线侵入非钙化软骨层，最终可蔓延至表层软骨，且骨软骨交界处血管密度与软骨退变严重程度呈正相关。相关研究发现［4］抑制血管异常生成可有效缓解KOA关节软骨退变，因此，抑制软骨新生血管形成可能是治疗KOA的新思路［5］。针刀治疗KOA疗效确切，本项目组前期［6］已经证实针刀通过其力学效应可以发挥对KOA软骨细胞的保护作用，并在一定程度上可以延缓KOA病理进程。本研究拟立足于观察针刀干预对KOA兔软骨血管分布及CD34、CD105、VEGF表达的影响，以进一步探讨针刀治疗KOA的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

28只健康清洁级，6月龄，雄性，新西兰兔（伦理编号：BUCM-4-2022010101-1097，动物许可证号：SYXK京2018-0041，北京富龙腾飞实验动物研究院有限公司），体质量2.0～2.5kg。标准动物饲养笼单笼饲养，标准饲料，自由饮食。保持室温恒定于（20±2）℃，湿度维持在40%～60%。

1.2 试剂与仪器

EDTA脱钙液（G1105，Servicebio）；HE染液套装（G1003，Servicebio）；胃蛋白酶消化液（Servicebio）；PBS缓冲液（G0002，Servicebio）；BSA（G5001，Servicebio）；苏木素染液（G1004，Servicebio）；一抗CD34（GENETEX-GTX28158-1∶100）；HR-山羊抗大鼠二抗（GB23302-1∶200，Servicebio）；一抗CD105（MA5-17041-1∶500，invitrogen）；一抗 p-h2ax（05-636-I-1∶50，millipore）；HRP山羊抗小鼠二抗（GB23301-1∶200，Servicebio）；ELISA试剂盒（CSB-E08524Rb）；组化试剂盒DAB显色剂（G1211，Servicebio）。组织摊片机（KDP，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）；染色机（Giotto，DIAPATH）；脱水机（JJ-12J，武汉俊杰电子有限公司），包埋机（JB-P5，武汉俊杰电子有限公司）；脱色摇床（TSY-B，Servicebio）；病理切片机（RM2016，上海徕卡仪器有限公司）；涡旋混合器（MX-F，Servicebio）；掌上离心机（D1008E，Servicebio）；显微镜（XSPC204，CIC）；立式冷藏陈列柜（LSC-316C，星星）；高速组织研磨仪（KZ-II，Servicebio）；台式高速冷冻离心机（D3024R，大龙）；酶标检测仪（Epoch，BioTeK）。

1.3 分组方法

实验动物适应性饲养7 d后，按照随机分配的基本原则分为空白组、模型组、电针组、针刀组，每组7只。针刀与电针均可通过刺激穴位达到治疗效果，但针刀较电针刺激强度更大，在发挥针刺作用基础上又可通过分解粘连、延长挛缩、减张减压直接作用于膝周“经筋”，故选取电针组作为阳性对照组，试图通过实验结果对比电针与针刀在治疗兔KOA的疗效差异。

1.4 造模方法

采用改良后Videman［7］左后肢伸直位固定制动法制备KOA模型兔，造模前所有实验动物均需经严格禁食约10～16 h。兔前后肢固定于操作台，以3%戊巴比妥溶液30 mg/kg耳缘静脉注射麻醉，左后肢腹股沟至足踝关节区域备皮，牵拉左下肢至膝关节完全伸直，以65～85℃热水充分浸泡树脂绷带至软化后，自腹股沟至足踝固定（保持膝关节完全伸直位180°，踝关节背屈约60°），留出足趾观察血供，以无色透明胶纸于树脂外包严扎以防兔撕咬。定时观察兔足趾血供情况及模型脱落情况，及时拆除模具，待恢复正常血运后再次制动。有效制动6周后，确认模型制备成功拆除树脂固定模具。

1.5 干预方法

各组动物均在拆除树脂固定后开始进行干预。电针组：固定并选取KOA兔患侧梁丘、血海、内膝眼和外膝眼穴进行电针干预治疗。取穴参照《实验针灸学》［8］，并结合动物比较学方法，根据比较解剖取穴法结合模拟骨度取穴法，选取上述腧穴进行治疗。采用一次性无菌针灸针，规格0.2 mm×13 mm（环球牌，苏州针灸用品有限公司）。以韩氏电针仪分别连接“梁丘-血海”“内膝眼-外膝眼”，选用疏密波，刺激频率2/100 Hz，强度3 mA，每次干预20 min，隔天1次，共3周。针刀组：固定并以龙胆紫在KOA兔膝关节股内、外侧肌腱止点；股直肌肌腱止点；股二头肌肌腱止点及缝匠肌、股薄肌和半腱肌的联合腱即鹅足腱；膝关节周围结节条索状物进行标记定位。选用汉章系列一次性针刀，规格0.3 mm×30 mm（北京卓越华友医疗器械有限公司）。常规步骤备皮、消毒，随后刺入针刀，刀刃与肌腱走向平行，刀体垂直于皮肤切面，按照“四步规程”进针刀，每处松解2～3下后出针刀并按压片刻止血。每周治疗1次，共3周。模型组：造模完成后每天1次正常抓取、捆绑固定（方法同干预组）。空白组：不作任何处理，每天正常抓取、捆绑固定（方法同干预组）。

1.6 标本采集与检测

1.6.1 HE染色 治疗结束后，各组动物以3%戊巴比妥溶液麻醉过量致死后立即打开关节腔，在无菌条件下，将直径为8 mm的环钻垂直放置于关节软骨面，在患侧膝关节胫骨、股骨软骨面中央负重区各截取深度为10 mm的软骨-软骨下骨复合体圆柱形组织块。将组织块放置于4%多聚甲醛充分固定后脱钙，常规制备石蜡切片、脱蜡、核染色、脱水封片处理。在光镜下观察软骨-软骨下骨复合体中钙化软骨层、非钙化软骨层血管分布情况。

1.6.2 免疫组织化学 将软骨-软骨下骨复合体组织块放置于4%多聚甲醛充分固定后脱钙，常规制备石蜡切片。在完成烤片、修复抗原、DAB显色、复染细胞核、脱水封片处理等一系列常规操作后，通过免疫组化染色在光镜下观察钙化软骨层、非钙化软骨层CD34、CD105的表达，其中DAB显出的蛋白阳性表达呈浅黄色或棕黄色。随后以Weidner计数法［9］计算微血管密度，先以低倍率（100倍）扫描切片，选择3个最高血管密度（“热点”）区域，再以高倍率（200倍）定向扫描3个热点区域，视野内允许最大数量微血管。由至少2名相对独立研究者分别对同一切片微血管的数量进行计数，取其平均值作为该切片的微血管密度（MVD），若计数差异超过10%，则需重新计数。

1.6.3 酶联免疫吸附检测 获得关节滑液及血清并置于-80℃冰箱保存，以ELISA试剂盒通过加样、加检测抗体、洗板，加酶、显色和终止反应等一系列常规操作后，检测滑液及血清中VEGF蛋白表达水平，其浓度由计算出的标准曲线查得。

1.7 统计学处理

应用SPSS20.0统计软件。计量资料以（）表示。符合正态分布及方差齐的数据资料采用单因素方差分析；不符合正态分布或方差不齐的数据采用非参数检验。P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异极具统计学意义。

2 结 果

2.1 各组HE染色结果

在光学显微镜下可以观察到HE染色中：空白组织胞核呈紫蓝色，胞质呈粉红色。空白组关节软骨表面光滑平整，细胞层次排列有序，分布及染色均匀，潮线完整，无血管通过，钙化层软骨或可见少量血管。模型组关节软骨表面可见部分剥脱、缺损，细胞分布不均匀，潮线上移且扭曲不规则，有血管通过，并到达非钙化层软骨。电针组关节软骨表层或可见剥脱，细胞分布较均匀，部分出现凋亡，潮线略扭曲、较规则，可见少量血管通过到达非钙化层软骨。针刀组软骨表层较光滑，细胞层次排列均匀，潮线较规则且清晰，偶见重复潮线，偶见少量或无血管穿过到达非钙化层软骨。如图1所示。

图1 各组软骨-软骨下骨复合体组织病理观察（HE染色，200倍）

2.2 各组免疫组织化学检测结果

见表1。免疫组化检验结果显示，与空白组相比，模型组MVD值均显著增加（P＜0.01）；干预后，相比模型组，电针组和针刀组MVD值均明显降低（P＜0.01），且针刀组显著低于电针组（P＜0.05）。

表1 各组MVD表达水平比较（±s）

表1 各组MVD表达水平比较（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01；与电针组比较，△P＜0.05。下同。

组别n CD34CD105空白组模型组电针组针刀组7 7 7 7 0.77±0.34 23.02±2.27*12.19±0.90#8.51±0.61#△0.97±0.48 25.34±2.38*12.31±1.43#7.61±0.75#△

2.3 各组血清及滑液中VEGF表达比较

见表2。与空白组相比，模型组血清及滑液中VEGF表达均明显升高（P＜0.01）；干预3周后，与模型组相比，电针组与针刀组血清及滑液中VEGF表达水平均有所降低（P＜0.01），且针刀组显著低于电针组（P＜0.05）。

表2 各组血清、滑液中VEGF表达水平比较（pg/mL，±s）

表2 各组血清、滑液中VEGF表达水平比较（pg/mL，±s）

组别空白组模型组电针组针刀组n 7 7 7 7血清VEGF 6.50±1.22 14.15±1.11*10.61±0.65#7.61±0.90#△滑液VEGF 6.69±0.85 12.99±1.35*10.27±0.37#8.14±0.47#△

3 讨 论

中医学认为，KOA属于“骨痹”范畴，“膝者，筋之府也”“筋者，肉之力也”“宗筋主束骨而利机关”，膝关节处筋为全身之最，发挥着包绕、约束骨骼和关节，络系肌肉皮肤以及维持动态及静态稳定的功能。现代解剖学认为，KOA的病理表现“筋伤”是由于膝关节周围生物力学失衡所导致的一系列病变，针刀松解法是在传统中医“经筋”理论指导下，结合现代解剖学理念，通过改善膝关节周围生物力学环境，恢复膝关节周围的正常力学平衡，发挥对软骨细胞的保护作用、延缓关节软骨退变［10］，以获得更加持续的治疗作用，从而丰富针刀“调筋治骨”内涵。生理条件下，软骨及软骨下骨是一个整体的功能单元，软骨下骨为其分散过度集中的应力。近年多项研究证实，膝关节周围异常的生物力学环境会直接影响到软骨下骨病变［11］，使关节软骨和软骨下骨过早变性，启动了骨重塑。Suri等［12］认为，在软骨下骨重塑过程中，软骨下骨异常增加的破骨细胞活动使得软骨下骨板与非钙化软骨层之间形成通道，同时裂隙自软骨表面向下延伸至软骨下板，被异常的新生血管占据同时深入至软骨钙化层。研究表明，软骨-软骨下骨复合体组织中的异常血管生成可能激发软骨内骨化，出现软骨细胞肥大、X型胶原表达升高［13］等表现，进而加速关节软骨钙化及退变。因此可以明确，膝关节周围异常生物力学环境会启动骨重塑，骨重塑过程中异常的血管生成又会加速软骨退变，针刀干预可以通过纠正膝关节周围力学失衡，减缓骨重塑，缓解异常血管生成，从而发挥软骨保护作用。

软骨退变作为KOA的根本病理表现，新生血管异常增生是软骨破坏的始动环节，缺氧诱导的软骨血管异常生成是KOA最早出现的病理特征之一，与KOA病程发展密切相关。最新研究［2］支持关节软骨异常血管生成水平可反映关节软骨退变及关节炎临床症状的严重程度。前期研究已经证实［14］KOA模型兔异常的关节应力环境改变会加速软骨退变。本课题组已从KOA软骨细胞凋亡、软骨细胞增殖、软骨细胞合成及分解代谢等几个方面证实了，针刀可以通过其力学效应发挥对KOA软骨细胞的保护作用。近年研究发现，KOA患者关节软骨间隙可见骨软骨连接处存在异常血管生成并延伸至关节软骨内，同时伴有软骨细胞退变、软骨基质钙化，由此可以明确抑制软骨中血管生成可以成为治疗KOA的新靶点［12，15］。

本实验通过HE染色观察到KOA发生时，软骨细胞代偿性启动血管生成，软骨下骨微血管侵入钙化软骨层，并随着KOA病程发展，骨与软骨交界处新生血管密度增加，同时潮线出现重复、结构趋于紊乱甚至消失，部分新生血管逐渐突破潮线，侵入非钙化软骨层，最终蔓延至表层软骨，这与Pesesse等［16］的发现相一致。与此同时，骨软骨交界处血管密度与软骨退变严重程度直接相关。CD34作为最敏感的血管内皮标志物［16］，其含量变化直接反映了骨关节炎软骨组织血管的多少；CD105直接参与血管生成，其特异性极好［17］。MVD计数作为标记血管生成的基本方法，MVD标志着血管形成活动效应。本实验通过免疫组化染色观察钙化软骨层和非钙化软骨层CD34、CD105表达，分别计算MVD值发现，模型组、电针组和针刀组MVD值均依次递减，且针刀干预疗效显著优于电针，差异有统计学意义。因此可以认为针刀干预通过抑制CD34、CD105的表达以达到减少血管重建的效果。

VEGF作为与血管生成关系最密切的细胞因子，可诱导新血管形成［18］，直接参与KOA软骨血管化，在关节炎发病机制研究中最为广泛且最具靶向性。除了促进KOA软骨新血管形成外，VEGF还抑制软骨中聚蛋白多糖和Ⅱ型胶原表达加速软骨基质降解［19］，而软骨基质最主要的组成成分——聚蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达减少将导致软骨退变。Saetan等［20］通过采集并检测KOA患者的组织液证实，其软骨中VEGF表达水平显著升高。本实验通过酶联免疫吸附检测观察血清及滑液中VEGF的表达，发现KOA兔模型中血清及滑液VEGF表达量均显著上调，与模型组相比，针刀和电针干预可以显著减少血清、滑液中VEGF含量，差异有统计学意义，且针刀组VEGF表达水平显著低于电针组。故可以认为针刀干预是通过抑制血清及滑液中VEGF的表达，从而达到减缓新血管生成的目的。

因此，通过上述实验结果可以认为针刀干预可以通过“调筋”恢复关节良性应力环境，有效抑制KOA软骨血管异常生成，发挥软骨保护作用从而“治骨”。