芽孢杆菌源Fengycin合成调控研究进展

王一凡,张飞燕,孟祥荷,王雅娜,米婧璇,刘洪伟 ,赵山山,张丽萍

(1.河北工程大学,河北 邯郸 056009;2.河北省科学院生物研究所,河北 石家庄 050052;3.河北省人民医院,河北 石家庄 050057)

0 引言

Fengycin是芽孢杆菌属微生物的次级代谢产物[1],是芽孢杆菌发挥抗生作用的重要物质[2],其结构、合成方式、特性、功能等不断被发掘。在结构上,由于Fengycin的脂肪酸部分如长度、分支、羟基化和肽链中氨基酸的类型及序列不固定,可以有多个组合,常以多个同系物的混合形式共存于细胞中。Fengycin具有低生态毒性、温和的生产条件、较高的稳定活性以及高度的生物降解性等优点,且在马铃薯晚疫病[3]、棉花黄萎病[4]、辣椒疫霉病[5]、水稻米曲霉病[6]、苹果青霉病[7]等多种植物病害,鸡禽流感[8]等动物病害以及结肠癌[9]和肿瘤[10]等人类临床疾病上都有一定的应用价值。但目前Fengycin产量低、生产成本高,严重限制了其生产应用。本文在阐述Fengycin生物合成的基础上对发酵工艺优化、诱变育种及基因工程理性设计提高发酵水平进行综述,以期为解决Fengycin产量低等问题提供理论参考。

1 Fengycin的生物合成

Fengycin是由非核糖体途径合成的脂肽类活性物质,在菌体生长停止之后合成的微生物次级代谢产物。Fengycin的肽环是由第3位的D-Tyr和末位的L-Ile以内酯键结合而成,再与带有14～18个碳原子的β-羟基脂肪酸以内酯键连接(图1)。

由于肽环上第3、4、6、9、10位氨基酸的变化,不同碳原子数的脂肪酸以及构型的差异使得Fengycin也存在许多同系物和同分异构体,如Fengycin A[11]、Fengycin B[12]、Fengycin C[13]、Fengycin S[14]等(表1)。

Fengycin由非核糖体肽合成酶NRPS通过腺苷酰化结构域识别、结合特定的氨基酸,并由ATP激活,激活的氨基酸与4-磷酸泛酰巯基辅基以共价键形式结合,再与缩合结构域特定部位结合,在缩合结构域的作用下,按相邻合成酶各组成模块的顺序依次向前直连接成多肽链。编码Fengycin的操纵子fen由合成酶的基因fenC、fenD、fenE、fenA、fenB共同构成,分别编码FenC、FenD、FenE、FenA和FenB单体酶,它们线性排列共享一个启动子。每个单体酶一般含1～3个氨基酸激活模块,且每个模块具有接受特定氨基酸及形成相应肽键的功能[15]。Fengycin的合成途径是启动子启动后,FenC组装前两位氨基酸L-Glu和D-Orn;FenD组装第三、四位氨基酸D-Tyr和D-Thr;FenE组装第五、六位氨基酸L-Glu和D-Ala;FenA组装七、八、九位氨基酸L-Pro、L-Gln和L-Tyr;FenB组装最后一位氨基酸L-Ile[16],组装完成后中断肽链合成从NRPS上释放出Fengycin。

2 Fengycin的合成策略

Fengycin在农业、医药、食品等行业中都具有应用价值,但因其合成生产存在产量低、成本高和规模小等问题,限制了其产业化应用。目前只有MedChemExpress、SigmaAldrich等少数企业能够微量生产。为了Fengycin能得到更加广泛的应用,主要通过发酵工艺优化、诱变育种及基因工程理性设计等策略提高其产量。

2.1 发酵工艺优化

发酵条件优化可提高菌株的Fengycin产量。目前优化主要集中在发酵培养基组分及发酵条件。Wei等人[17]通过单因素试验得到的培养基配方为木糖20.00 g/L、豆粕21.90 g/L、NaNO33.10 g/L、MnSO4·H2O 0.20 g/L,初始pH为7.50,转速为180 r/min,发酵温度为30 ℃,此发酵策略使菌株168DSABA的Fengycin产量提高了4.26倍。Maliheh等人[18]通过添加氨基酸来提高菌株UTB96的Fengycin产量,添加赖氨酸将Fengycin产量提高了27%,添加丙氨酸将Fengycin产量提高了47%。陈晓萌[19]通过响应面优化试验得到的培养基配方为玉米粉3.85%、黄豆饼粉1.57%、FeSO4·7H2O 0.03%、NaH2PO4·2H2O 0.02%、Na2HPO4· 2H2O 0.04%,初始pH为7.00,接种量为8.50%,转速为190 r/min,培养温度为37 ℃,培养时间为33 h,用优化后的发酵条件进行发酵培养菌株Z-14使得Fengycin的产量提高了4.19倍。

2.2 诱变育种

通过菌种改造获得高产Fengycin的菌株更具有实际生产意义,诱变育种是一种选育高产菌株的方法。陈尚里等人[20]通过紫外-ARTP-LiCl化学复合诱变选育高产菌株,先经紫外诱变,与野生型菌株YA-215对比,突变菌株mutUV503的Fengycin产量从113.02 mg/L提高到221.39 mg/L,将突变菌株mutUV503继续ARTP-LiCl诱变,与突变菌株mutUV503对比,突变菌株mutUA397的Fengycin产量从221.39 mg/L提高到388.34 mg/L,复合诱变后Fengycin的产量提高了3.44倍。高兆建等人[21]采用紫外线-硫酸二乙酯化学复合诱变的方法,诱变菌株XF32,将突变菌株XF32-22所产Fengycin的抑菌活性提高了1.53倍。

2.3 基因工程理性设计

随着合成生物学的发展,基于合成生物学基础利用基因工程手段改造菌种对Fengycin的代谢途径进行理性设计提高Fengycin的产量是未来的发展方向。基因工程手段主要包含启动子替换、前体物质合成途径设计、转录调控基因改造、分泌途径改造等。

2.3.1 启动子替换

Fengycin的合成基因簇长达37 kb,利用过表达方式来提高Fengycin的产量难度较大,而启动子可以决定基因表达水平,因此替换fen启动子成为提高产量的有效手段。替换启动子主要是选择天然强诱导型启动子及人工嵌合诱导启动子。Jin等人[22]将Fengycin生物合成基因簇的原生启动子替换为阶段依赖型启动子PYLB,Fengycin产量从121.20 mg/L提高至137.05 mg/L。Yaseen等人[23]将来自B.subtilisBBG111的PPPS启动子替换为来自BBG21的PFEN启动子时,Fengycin的产量提高了约10倍。

2.3.2 前体物质合成途径设计

在Fengycin合成过程中,脂肪酸及氨基酸前体的生物合成是第一步,前人对氨基酸及脂肪酸供应改变是否会影响Fengycin产量进行了相关研究。Gao等人[24,25]提高脯氨酸转运相关基因opuE的表达量后,添加8.00 g/L外源脯氨酸,枯草芽孢杆菌Fengycin的产量从753.47 mg/L提高到871.86 mg/L;通过上调脂肪酸途径中相关基因的表达,将Fengycin产量从174.63 mg/L升高至258.52 mg/L。Shu等人[26]分析了由fenE编码的酶的功能,它包含两个氨基酸激活模块,FenE1和FenE2,FenE1激活L-Glu,FenE2激活和L-Ala、L-Val和l-2-氨基丁酸,这解释了为什么枯草芽孢杆菌F29-3产生了两种类型的Fengycin——Fengycin A和Fengycin B,与L-Ala相比,L-Val是FenE2体外更好的底物,这一发现与菌株F29-3产生的Fengycin B通常是Fengycin A的2倍的观察结果一致。

2.3.3 转录调控基因改造

Fengycin的合成需要多种调控因子参与,可通过过表达或敲除这些调控因子的基因提高Fengycin产量。Lu等人[27]通过转录组分析发现培养基中添加果糖改变了氨基酸合成、脂肪酸代谢和能量代谢的转录,这些代谢途径的改变有助于Fengycin的合成,使得Fengycin操纵子的表达水平提高了2倍。Gao等人[28]将编码Dahms木糖利用途径的基因整合到菌株168的amyE位点,并基于Dahms途径的代谢特性,敲除乙酸激酶(ACKA)和乳酸脱氢酶(LDH)基因,将乙醛转化为苹果酸和草酰乙酸,乙醇醛再循环到TCA循环中,从而产生菌株BSU03,Fengycin的产量较原菌株增加了87%。

2.3.4 分泌途径改造

对Fengycin分泌途径的改造,可通过强化表达参与其分泌的跨膜蛋白增加产出。Fu等人[29]基于iTRAQ的菌株NCD-2蛋白组学分析PhoPR双组分系统调控,与转录组学的比较分析揭示了支链氨基酸对Fengycin生成的调控,PhoPR双组分系统(TCS)是一种信号转导途径,用于调节菌株的磷酸盐饥饿反应,并调节低磷酸盐条件下菌株NCD-2中Fengycin的产生,研究结果表明,PhoPR TCS通过影响支链氨基酸生物合成来调节Fengycin的产生。Zhao等人[30]对亲本菌株ES-2-4和基因组重排菌株FMB72进行了比较蛋白质组学分析,以检测差异表达的蛋白质,在鉴定的44个蛋白中,信号蛋白Com A和Spo0A可能在转录水平正调控Fengycin的合成。

3 展望

Fengycin具有低毒性、较高稳定性和高度生物降解性等优势属性,在农业、医药、食品等领域有很大的应用前景。Fengycin在实验室研究阶段已取得一定进展,但其大规模产业化仍受限于发酵工艺、生产菌种和生产成本等因素。展望未来,在发酵工艺方面,发酵液的泡沫分离及下游的提取纯化等问题亟待解决。在诱变育种方面,开发新的高效诱变方法诱变高产菌株、新筛选方法减少高产菌株筛选的工作量。在基因工程理性设计方面,还需要探索效果更好的启动子,寻找更合适的氨基酸及脂肪酸供应途径,研究调控因子参与合成的方式,从而提高Fengycin产量。