猪胸膜肺炎放线杆菌（15型）的分离鉴定

文│南祥祝 徐晨 王辉 丁美娟 何召庆［兆丰华生物科技（南京）有限公司］

猪传染性胸膜肺炎（PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（APP）引起的一种猪的致死性呼吸道传染病。该病在我国发病率常年居高不下，以出血性、坏死性胸膜肺炎为主要特征，任何年龄的猪均可发生，可引起猪的急性死亡，给养猪业带来较大的经济损失。该病的慢性和无症状感染是暴发流行的潜在因素，因此，早期诊断是防治该病成败的关键。

一、疾病概况

2022年4月，浙江某猪场50～70千克的两头育肥猪不明原因突然死亡，一周后陆续有病猪出现，相继经产母猪、仔猪、保育猪均有病例发生，死亡病例也逐渐增多。病猪临床表现为高热，体温高达41～42℃，精神沉郁，呼吸困难，食欲降低，耳、鼻、胸腹、阴部和四肢等部位皮肤发绀，口腔和鼻腔内流出或存在带血泡沫样分泌物。猪场兽医根据临床症状分析，初步诊断为猪传染性胸膜肺炎，经氟苯尼考等抗生素药物治疗，未见好转。

二、病理变化

剖检病死猪可见败血症，肺肿胀，间质增宽，有明显血色胶样液体；肺表面呈暗红色，布满凝血块，切面易碎，病变明显，伴有纤维素性渗出，肺与胸壁有明显的黏连；喉头、气管、支气管黏膜出血，充满大量血样泡沫；心包有淡黄色积液，与胸膜有粘连；胸腔内有血样液体；全身淋巴结肿大、充血。

三、实验室诊断

1.病料来源。胸膜肺炎放线杆菌感染猪只后，在病死猪扁桃体和肺中检出率较高，支气管分泌物、胸水中也能分离到病原。本次试验材料来源于现场解剖过程中按照无菌操作程序采集的扁桃体和肺样本。

2.病原分离与形态观察。NAD依赖性：将病料样品接种于血琼脂培养基表面，并用金黄色葡萄球菌在血琼脂培养基表面交叉于病料接种区划线，结束后将培养皿做好标记，置于37℃含有5%的CO2环境中培养。在血琼脂培养基上，病料样本培养物靠近金黄色葡萄球菌处生长旺盛，远离后则变小甚至看不到菌落生长，说明该菌株生长对NAD有需要。

β型溶血：在血琼脂培养基表面，样本接种生长菌呈乳白色露珠状，中间稍微隆起，具有β型溶血带。

菌落形态观察及镜检：将病料样本接种于改良的TSA（含NAD因子）平板培养基上，结束后做标记，同上述条件培养，24小时后观察菌落生长状态，然后挑取生长优势菌落进行纯化培养，相同条件培养24小时后观察菌落特点并染色镜检。在改良的TSA（含NAD因子）平板培养基上，纯化分离菌表现为半透明的露珠样小菌落，菌落呈圆形突起、针尖大小、边缘整齐、表面光滑湿润。挑取纯化后的分离菌落进行革兰氏染色，再置于显微镜下镜检，该菌为两极着色的阴性、球状小杆菌，少数呈丝状。

3.PCR鉴定。

（1）APP鉴定。挑取纯化培养后的菌株接种于改良的TSB（含有NAD因子）液体培养基，37℃摇菌8小时，然后利用试剂盒提取基因组作为DNA模板进行PCR鉴定。

按参考文献报道序列合成APP通用引物，设置反应体系和条件进行PCR扩增，预扩增片段大小为422bp。结果显示，在250～500bp之间出现一条明显的扩增条带（如图1），与目的条带大小相符，表明该分离菌株为APP。

◎图1 胸膜肺炎放线杆菌鉴定

（2）血清型鉴定。首先，合成各APP1～18血清型和nadV（NAD依赖性测定）引物，再利用上述提取的基因组作为模板，设置反应体系和条件进行PCR扩增，最后在凝胶中观察结果。结果如图所示（图2），3型和15型APP引物处扩增出了明显的条带，3型引物扩增出现的条带与预期大小（500bp）不相符，为非特异性条带；在15型APP引物处扩增到了明显的特异性条带，大小为1500bp左右，与预期条带1595bp相符；在nadV处未扩增出明显条带，为阴性结果，说明该菌株对NAD具有依赖性。鉴定结果表明，分离到的菌株属于生物学Ⅰ型血清学15型APP。

◎图2 猪胸膜肺炎放线杆菌血清型鉴定

四、药物敏感性试验

纸片琼脂扩散法：挑取APP纯化培养菌落涂抹接种于改良的TSA（含NAD因子）琼脂平板培养基上，用无菌镊子将药敏纸片贴于培养基表面，稍用力压实，置于37℃恒温箱内培养18小时后观察结果（图3）。

◎图3 分离株APP药物敏感试验

根据抑菌圈大小对照参考标准判定APP分离菌的耐药性，此次分离菌对头孢吡肟、阿莫西林、复方新诺明、头孢噻肟4种抗生素表现出高度敏感，对多西环素和青霉素敏感度偏低，对庆大霉素、链霉素、氟苯尼考和环丙沙星4种抗生素耐药。

五、结果

组织样品经血琼脂平板和改良的TSA琼脂（添加NAD因子）平板培养及革兰氏染色镜检后分离到可疑菌落，经形态观察和染色镜检，其形态特征与APP表现一致，符合胸膜肺炎放线杆菌培养的典型特征，且对NAD因子具有依赖性，符合猪胸膜肺炎放线杆菌生物学Ⅰ型的特点。

将样品进行PCR鉴定，确定分离菌株为血清15型APP。

综合上述结果，判定病料样品中存在胸膜肺炎放线杆菌，且属于生物学Ⅰ型血清学15型菌株，确诊此次疫情为猪传染性胸膜肺炎。

六、防治

疫情的单一防控措施会使效果下降，猪传染性胸膜肺炎的防控需以综合方法为主，这样可以缩短治疗时间，提高治疗效果。

在不同地区、不同猪场、同一养猪场的不同时间和用药习惯情况下，APP对药物的耐受性存在一定的差异，因此，对分离的APP选择适合的治疗药物时需进行药敏试验。经药敏试验结果可知，此次感染菌株对头孢吡肟、阿莫西林、复方新诺明、头孢噻肟等表现出了高度的敏感性，结合猪场实际双方兽医制定出了综合治疗方案。

清理圈舍，用消毒液对环境进行消毒，每天2次。

对受威胁猪群进行阿莫西林全群投药控制疫情发展，同上调整营养结构增强抗病能力，并密切观察猪群状态，发现疑似症状病例立即进行药物注射。

发病猪只的早期治疗是降低损失的有效方法，建议发病猪尽早肌内注射头孢吡肟和阿莫西林，早晚各一次。

全场采取以上措施3天后无新发病例出现，疫情得到控制。发病猪只一般在2～3天治疗后可基本痊愈，巩固治疗1～2次，1次/天，均未再发。

七、讨论

猪胸膜肺炎放线杆菌主要定植于猪呼吸道，通过空气传播感染，是危害养猪业的重要病原。该病原也可通过猪只直接接触或短距离飞沫传播，运输车辆、饲养工具等被污染，饲养人员大面积流动、鼠和鸟类的传播使PCP在某些地域呈现流行性，此外，患有基础性疾病的猪群对APP的易感性增强。

用PCR的方法检测APP，不仅具有敏感度高、特异性强、检测速度快等优点，还可同时检测多个样品，是目前实验室中常用的APP检测方法。本次针对患病猪群的诊断，首先是结合临床症状和病理变化进行综合分析，充分掌握猪群发病的关键信息，确定诊断方向，然后利用实验室PCR技术得出确诊结果，不但准确性高，还极大缩短了诊治时间，对早期确诊和治疗具有十分重要的意义。

胸膜肺炎放线杆菌血清型众多，已有报导就有18个，不同国家和地区的流行存在较大差异。在本次实验室诊断过程中，对感染病原进行了血清型鉴定，结果表明，在病料中分离出的APP属于生物学Ⅰ型血清学15型菌株，该型菌株并非主流流行的血清型，因APP各血清型之间的交互免疫力比较差，本次诊断对APP各血清型流行的动态监测和相关疫苗研发具有重要意义。