口蹄疫液相阻断ELISA试验方法应用

文│刘占艳（山东省无棣县畜牧兽医管理服务中心）

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的，主要引起偶蹄动物的一种急性、烈性、危害性大的传染病，以O型和A型血清型多发。该病发病速度快，传播范围广，对畜产品质量安全和进出口贸易造成重大危害，不利于畜牧业的绿色健康发展。

一、口蹄疫的诊断方法

1.临床诊断。口蹄疫是RNA病毒，为二十面体的球形结构，主要感染牛、羊、猪等偶蹄兽，发病速度快，传染性强，病程3～10天，发病率100%，感染动物出现发热、精神萎靡、食欲减退，主要特征是口、蹄、鼻等部位出现水泡，破损后留有结痂。幼龄动物感染后，如果护理不到位，死亡率100%，成年动物感染后，消瘦、生产能力下降，部分动物自愈后，无明显症状，会长期带毒，成为隐性感染，给畜产品交易和食品安全带来重大隐患。

2.实验室诊断。在基层兽医实验室，主要应用液相阻断ELISA实验方法检测偶蹄动物的血清，不足之处是耗时费力，检测通量低。笔者在多年动物疫病实验研究基础上优化了检测方法，提出高通量液相阻断ELISA口蹄疫病毒检测法，检测的准确性提高2～3倍，节约了时间，节省了移液枪头等实验耗材，降低了检测成本。做好高通量液相阻断ELISA实验方法的关键因素是确定合适的血清稀释倍数，考虑不同稀释倍数有不同的检测范围，试验中把羊血清直接配比稀释成1∶8，可以保证检测数据的准确性和真实性，更好地为养殖户提供批量检测。

二、口蹄疫液相阻断ELISA抗体检测方法

该方法的原理是在液相条件下将待检血清与病毒反应，病毒与特异性抗体充分结合，推断出待检血清中特异性抗体的数量。笔者从事兽医实验室抗体监测工作十余年，现以检测20份羊血清的O型口蹄疫病毒为例，将高通量液相阻断ELISA试验方法的工作经验总结如下。

1.检测样品。采集20份羊全血样品后应尽快分离出血清（样品不能有溶血状态、受污染、破损、变质)，编号为S1～S20。

2.试验器材。酶标仪；37℃恒温箱；超纯水仪；单道和多道移液器；配套移液枪头；96孔U型血清稀释板；移液槽；吸水纸；检测试剂盒是兰州兽研生物科技有限公司生产的口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒（改进型）。

3.实验操作步骤。稀释20份羊血清需要1块96孔U型微量稀释板，在血凝板边缘标记数字（横向标记为1～12，纵向标记为A～H）。先在稀释板的A1～A10、B1～B10孔中加入PBST稀释液140微升/孔，然后在以上20孔加入待检血清样品20微升/孔，混匀后把血清混合液取出100微升移到抗原包被板的A1～A10、B1～B10孔中，并做好标记。

包被板C、D、E、F、G、H列的1～10孔分别加入PBST稀释液50微升/孔。再用10～300微升8道或12道移液器以50微升/孔的量稀释从第A～D列S1～S10血清混合液，DS1～DS10混合液吸出50微升弃掉。第E～H列S11～S20样品同上依次稀释，HS11～HS20混合液吸出50微升弃掉。

阳性对照稀释：在抗原包被板A11～H11孔先加入PBST稀释液50微升/孔，然后在A11孔中加入阳性对照血清（已稀释浓度为1∶8）50微升，混匀后以50微升/孔的量依次稀释到H11孔，从H11孔中吸出50微升弃掉。阴性对照稀释：在抗原包被板A12～B12孔先加入PBST稀释液50微升/孔，然后在A12孔中加入阴性对照血清50微升，混匀后吸出50微升移到B12孔，从B12孔中吸出50微升弃掉。

由表3可知，抗体效价大于或等于1∶128时判定为口蹄疫O型抗体阳性，抗体效价1∶64～1∶128判为可疑，小于1∶64判为阴性。读数结果：本次试验ELISA包被板试验结果有效，计算出OD值＝0.87，抗体阳性孔数20个，抗体阳性合格率100%。

表3 20份羊血清O型口蹄疫检测结果

4.分析与总结。在液相阻断ELISA抗体检测试剂盒说明书的基础上，结合工作实际经验，待检血清提前进行倍比稀释，倍比稀释后再把血清稀释液从稀释板转移到包被板上。本次试验中把羊血清直接配比成1∶8，将混合均匀的血清稀释液按100微升/孔的量，从稀释板直接移到包被板A1～A10孔中，然后取50微升/孔，用多头移液枪在包被板上直接稀释成所需比例。

高通量液相阻断ELISA试验方法的好处：保证血清稀释液移板时是足量的，节省了稀释后移板的一部分时间，按转移1个血清样品用时5秒计算，20个样品可节时1.5分钟，提高了工作效率；节省大量的移液枪头，节省了试验耗材，可用于大批量的口蹄疫免疫效果检测；用PBST稀释液洗板时，若洗涤液少了洗板不均匀达不到洗板效果，若洗涤液多了在操作过程中容易溢出造成混孔混样，笔者根据多次试验经验认为用量260～280微升/孔较好。

三、口蹄疫液相阻断ELISA的重要意义

1.促进畜牧业绿色发展。现如今，人类新发疾病绝大多数来源于动物和动物源性食品，通过免疫无疫区高标准的建设，有效控制和扑灭了重大动物疫病，有效保护了人类生命安全和维护公共卫生健康。建立健全生物安全工作环境，最大限度地减少动物疫病流行造成的社会和经济损失，减少了人畜共患病和动物性食品残留对人体的危害，降低动物疫病带来的食品安全风险给社会提供安全放心的食品。

2.提升畜产品质量安全。通过对动物疫病免疫效果的检测可以推动免疫无疫区的建设，进一步推进无疫区绿色、安全、放心畜产品品牌的影响力，全方位提高畜产品市场占有率，培育优质畜产品新品牌，提升新品牌建设和畜产品质量品质，提高畜产品出口贸易，吸纳国内外饲料、兽药和科研机构等来无疫区投资生产。

3.助力“无疫区的建设”。山东省在全国率先推行强制免疫“先打后补”，又于2022年7月初通过了全国动物卫生风险评估专家委员会的审议，成为首个全省域通过口蹄疫、高致病性禽流感“双病”无疫区的省份。无棣县地处山东省的北大门，将切实筑牢动物疫病防线，擦亮“无疫省”金字招牌，依靠县疫控中心兽医实验室，利用口蹄疫液相阻断ELISA等检测方法可更好地做好口蹄疫、高致病性禽流感的抗体检测工作，提供科学、有力、坚实的数据做支撑，为维护“无疫省”和强制免疫“先打后补”高标准、高水平长效运行，进行保驾护航。

四、结语

近些年，全球疫情频发，口蹄疫作为重大动物传染病，在我国主要为O型和A型，呈零星散发，给畜牧业发展和畜产品交易带来不利影响。为了减轻动物疫病的发生，我国采取因地制宜、强制免疫和疫病持续监测净化的防控措施。通过液相阻断ELISA等检测方法，降低了成本，提高了检测效率和准确度，及时评价疫苗免疫效果，实现更为经济、高效的检测口蹄疫疫情，助力畜牧业持续绿色健康发展。

表2 96孔包被板加入20份血清布局图