液相色谱-串联质谱法测定样品中地西泮残留量的不确定度分析

杨嘉丽，林诗婷

（广东省湛江市质量计量监督检测所 国家海产品质量监督检验中心（湛江），广东湛江 524096）

地西泮，又名安定，属于镇静剂类处方药物，在渔业养殖中被用于减轻鱼体的环境压力。但在鱼体内残留的地西泮可通过食物链传递给人，超过剂量后会引起嗜睡、动作失调，严重的会出现心律失常等症状[1]。测量不确定度是指与测量结果相关联的参数，表征可以合理地赋予被测量值的分散程度[2]。本文针对罗非鱼中的地西泮项目，结合试验方法和实际的操作情况，对其进行不确定度的评定。

1 材料与方法

1.1 试剂

乙腈、冰乙酸、乙酸铵、氨水、甲酸均为色谱纯；无水硫酸钠为分析纯；QuEChERS吸附剂、地西泮标准储备液（100 μg·mL-1）购自 First Standard。

1.2 仪器

高效液相色谱四级杆质谱/质谱仪：配有电喷雾离子源（Thermo Fisher公司）；色谱柱：C18，150 mm×2.1 mm，粒径 3.0 μm。

1.3 测量数据

通过标准曲线校正法，用液相色谱-质谱/质谱法测定样品中的地西泮含量。在同一条件下，通过在空白样品中加入地西泮标准溶液，分别做10个平行样进行处理，最终定容2.0 mL上机测试。得到的数据如表1所示。

表1 试样测量结果

1.4 不确定度的评估程序

1.4.1 含量计算

建立数学模型样品中地西泮残留量的计算公式为

式中：Xi为试样中地西泮的含量，μg·kg-1；Csi为标准液中待测组分的含量，μg·L-1；Ai为试样中地西泮的峰面积，积分单位为A；Asi为标准中地西泮的峰面积，A；V为定容体积，mL；m为试样的质量，g。

1.4.2Xi的合成标准不确定度

由式（1）所得Xi的合成相对标准不确定度公式为

1.4.3 扩展不确定度

置信概率P=95%，取包含因子k=2，得到扩展不确定度为

2 标准不确定度的计算

2.1 标准溶液中地西泮浓度的相对标准不确定度ur(Csi)分析

测量样品中地西泮的浓度标准不确定度分量由两部分构成，其一是由标准溶液的浓度——峰面积拟合的一次曲线求得地西泮的浓度时所产生的不确定度，记为u1(C)；其二是由地西泮标准溶液配制成不同浓度的标准溶液系列时所产生的测量不确定度，记为u2(C)。

2.1.1 校准曲线拟合的不确定度ur(C0)的计算

由表2得地西泮校准曲线方程表示为

表2 校准曲线各标准点的峰面积测量值

式中：x为溶液中地西泮的浓度，μg·mL-1；I为峰面积；b为曲线的斜率，b=17 172；a为曲线的截距，a=-2 630。

本次实验，对地西泮标准溶液进行测量，对样品中地西泮含量测量10次，浓度为C0=4.882 8 ng·mL-1，则u1(C)计算公式表示为

将上述各值代入公式（3）得出：

u1(C)=0.058 1 ng·mL-1

ur(C0)=u1(C)/C0=0.058 1/4.882 8=0.011 9

2.1.2 地西泮标准溶液配制时所产生的测量不确定度ur(C)

绘制校准曲线的标准系列，地西泮的浓度可表示为

式中：V10.0mL表示定容体积为10.0 mL；V1.0mL表示量取体积为1.0 mL；V100μL表示量取体积为100 μL；Vi为量取体积，mL；C1为地西泮标准的浓度，μg·mL-1；1 000 为体积单位换算。

则C的相对标准不确定度计算公式为

（1）体积的相对标准不确定度。10.0 mL标准不确定度ur(V10.0mL)的分析。使用10.0 mL容量瓶配制溶液，其不确定度主要包括3个部分。容量瓶体积的不确定度，根据《实验室玻璃仪器 单标线容量瓶》（GB/T 12806—2011）规定：标称10.0 mL容量瓶的A级容量允差为±0.020 mL[3]，给出的不确定度的数值没有置信水平或分布情况信息，因此假设是矩形分布。按照矩形分布换算成标准偏差为充满液体至容量瓶刻度的估读误差为±0.005V10.0，按照均匀分布换算成标准偏差为容量瓶和溶液的温度与校正时的温度不同引起的体积不确定度，实验室温度在（20±4）℃变动，对水体积膨胀系数为2.1×10-4℃-1，则 95% 置信概率（k=1.96）时体积变化的区间为 ±10×4×2.1×10-4=±0.008 4 mL，转换成标准偏差为0.008 4/1.96=0.004 mL。

1.0 mL移液枪的相对标准不确定度ur(V1.0mL)的分析。移液枪的校准证书上标明相对扩展不确定度U=（50/V）%（k=2），则在移取1.0 mL时移液枪的标准不确定度u（V1.0mL）=U/k，故

100 μL 移液枪的相对标准不确定度ur(V100μL)的分析。移液枪的校准证书上标明相对扩展不确定度U=（50/V）%(k=2)，则在移取 100 μL 时移液枪的标准不确定度u(V100μL)=U/k，故

（2）标准纯度的相对标准不确定度ur(C1)的分析。供应商在证书上给出的地西泮标准纯度是100 μg·mL-1，扩展不确定度是 ±5%。所以标准纯度的不确定度为

则C的相对标准不确定度计算为

2.1.3 样品中地西泮的浓度相对标准不确定度ur(Csi)

样品中地西泮含量浓度的相对标准不确定度为

2.2 标准中地西泮峰面积引入的相对标准不确定度ur(Asi)

先取浓度为0.5 ng·mL-1地西泮标准，在相同条件下取标准样品连续进样6次，得标准样品中地西泮的6个响应值（峰面积）：4 968、5 117、5 080、5 265、4 941和5 272，平均值(Asi)=5 107.2，则地西泮峰面积的相对标准不确定度ur(Asi)为

2.3 样品中地西泮峰面积标准不确定度ur(Ai)分析

本次实验在相同条件下对样品中的地西泮进行重复测量10次，测量结果：峰面积（A）：81 543、81 036、82 262、81 860、80 912、81 296、81 373、82 201、80 882和81 214，峰面积的平均值=81 457.9，则u(Ai)为

2.4 样品称量的相对标准不确定度ur(m)的分析

准确称取样品2 g左右，使用的天平具有0.1 g的分辨率。称量的不确定度来源于以下3方面。①重复性。称量变动性，因不确定度较少可忽略。②可读性（数字分辨率）为0.029 g。③天平校准产生的不确定度分量，按检定证书给出的在95%置信概率时为±0.1 g，换算成标准偏差为0.1/1.96=0.051 g。样品质量的标准不确定度为

样品质量的相对标准不确定度为

2.5 定容体积的相对标准不确定度分析ur(V)

最后溶解残渣定容时，使用的2.0 mL的分度吸量管，根据《实验室玻璃仪器 单标线吸量管》（GB/T 12808—2015）规定：标称2.0 mL单标线吸量管的A级容量允差±0.010 mL[4-5]，给出的不确定度的数值没有置信水平或分布情况信息，因此假设是属于矩形分布。2 mL分度吸量管的标准不确定度相对标准不确定度为

3 样品中地西泮残留量的合成相对标准不确定度

样品中地西泮残留量的合成相对标准不确定度为

4 扩展不确定度分析

取包含因子k=2（近似95%置信概率），得到扩展不确定度为U=0.164×2=0.328 μg·kg-1。样品中地西泮的含量为X=（4.835±0.328）μg·kg-1。

5 结论

由上述合成标准不确定度的计算结果可以看出，样品称量和标准溶液的不确定度的贡献比较大，表明称样时使用的天平以及配制标准溶液时使用的移液管、移液枪、容量瓶的不确定度是影响整个实验的重要因素，因此实验室检验员在操作的时候应当尽量选择精密的仪器。