血浆miR-9-3p的表达水平与2型糖尿病的关系及其临床意义

孙雅楠　尹明洁　米颖　李斯

【摘要】  目的  探讨代谢相关microRNA，microRNA-9-3p（miR-9-3p）在2型糖尿病（T2DM）患者血浆的表达水平，并评价血浆水平miR-9-3p对T2DM的诊断价值。方法  选取2017年1月- 2019年6月医院T2DM患者47例为T2DM组；健康人员28例为对照组。抽取患者静脉血，提取miRNA，应用实时荧光定量PCR法（quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR），检测两组血浆中miR-9-3p表达水平；应用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）分析血浆miR-9-3p对T2DM的诊断价值，评价诊断结果的真实性和一致性。结果  T2DM组血浆miR-9-3p的表达水平显著升高（P<0.001）；ROC曲线显示miR-9-3p对于T2DM的诊断价值，AUC=0.742（95%CI：0.628～0.857，P=0.0005）；以血浆miR-9-3p表达水平（2-∆CT转换后）>0.00985为诊断T2DM的标准，诊断结果显示，灵敏度=68.085%，特异度=100.000%，具有较高的真实性，并且Kappa=0.614，诊断结果与实际结果高度一致，具有临床应用价值。结论  T2DM患者血浆miR-9-3p的表达水平显著升高，miR-9-3p对于T2DM精准诊断有一定诊断价值。

【关键词】   microRNA-9-3p；2型糖尿病；ROC曲线

中图分类号  R587.1    文献标识码  A    文章编号  1671-0223（2023）05--04

糖尿病分为4种类型，包括1型糖尿病、2型糖尿病（T2DM）、特殊类型糖尿病以及妊娠期糖尿病，其中T2DM患病率最高，以代谢紊乱为主要表现的终身性疾病。在T2DM病程中，患者体内的糖、脂代谢紊乱，并且其相关调节因子的表达水平也发生变化[1-3]。在人体代谢调节的众多因子中，microRNA是重要的组成之一，它广泛存在于体液、血液等人体循环系统中。研究表明miR-9-3p与体内糖代谢、脂类物质代谢调节相关，在胰岛组织中的β细胞内，miR-9-3p高表达，发挥抑制胰岛素分泌的作用[4-5]。还有报道显示，miR-9-3p通过细胞内胆固醇调节因子，影响体内胆固醇等血脂的代谢。T2DM发病机制为胰岛素抵抗及胰岛素分泌绝对减少，miR-9-3p在这两个过程中均有重要作用[6-7]。但国内外关于T2DM患者血浆中miR-9-3p表达水平的研究较少。本研究探讨血浆miR-9-3p的表达水平与T2DM的关系及对T2DM的诊断价值。

1  对象与方法

1.1  研究对象

研究选取2017年1月至2019年6月医院收治的T2DM患者47例为病例组（T2DM组）。糖尿病诊断标准：葡萄糖耐量试验：15min内缓慢口服溶于300ml温水内的无水葡萄糖粉75g，检测空腹静脉血糖≥7.0mmol/L，糖水负荷后2h静脉血糖≥11.1mmol/L，即可诊断糖尿病。T2DM患者纳入标准：①根据OGTT实验，符合糖尿病诊断的患者；②体质量指数（BMI）为18.5～30.0；③无影响血糖代谢的相关疾病。排除标准：①检出糖尿病自身抗体的患者，如已确诊1型糖尿病的患者；②验室检查提示C肽水平极低甚至缺乏的患者；③药物难治性血压患者；④肝转氨酶水平升高，如谷草转氨酶≥正常值范围上限的2.5倍；⑤慢性肾衰竭3级以上；⑥糖尿病急性并发症如高深昏迷及酮症酸中毒；⑦手术、外伤、感染及其它应激状态为近3个月内发生；⑧有严重的其他系统性疾病；⑨正处于妊娠期、哺乳期的患者。同期选取年龄、性别等与T2DM组相匹配的健康人员28例为对照组。本研究由唐山工人医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2  资料收集

内容包括研究对象的人口学资料、现病史、既往史、个人史、体检及实验室检测资料等。

1.3  实验室检测

1.3.1  血浆中总RNA的提取  本部分实验使用mirVana Paris Kit试剂盒，根据试剂盒的说明书提取总RNA，并且本部分操作完成后，将标本存放于-80℃冰箱冻存。

1.3.2  cDNA的合成  首先配置RT-PCR的反应体系，体系包括：10×缓冲液0.8μl、dNTP0.2μl、抑制剂0.1μl、RNA 4.5μl、无酶水体积为0.4μl、RNA 引物为1.5μl、RTase0.5μl（总反应体系为8μl），本部分实验全过程于冰浴中完成。进一步设定反应的条件：16℃进行孵育60min、42℃孵育60min、85℃孵育5min、4℃无限循环保存。

1.3.3  qRT-PCR实验  首先配置qRT-PCR 反应体系，体系包括：2×TaqMAN universal PCR Master 混合物10μl、cDNA为4μl、无酶水5μl、TaqMAN probe1 μl（总反应体系为20μl）。设定反应条件为：95℃10min起始模板预变性，95℃15s中模板变性、60℃60s退火循环40次；本实验每个样本均做副管，并且进行重复3次，实验结束后记录实验CT值，取平均值，后经2-∆CT转换后进行统计学分析。

1.4  數据分析方法

采用SPSS 17.0以及GraphPAD Prism 5.0 统计软件进行数据统计分析及作图。计数资料计算百分率，两组间率比较采用卡方检验；正态分布的计量资料使用“±s”表示，两组间均数比较采用独立样本t检验；非正态分布的计量资料用M（P25，P75）来表示，两组间中位数比较采用Kruskal-Wallis秩和检验。应用ROC曲线评估血浆miR-9-3p的表达水平对T2DM的诊断效能，并筛选临界值。计算灵敏度、特异度、Kappa值评价血浆miR-9-3p的表达水平对T2DM的诊断效果。P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  T2DM组与对照组基本特征比较

T2DM组及对照组性别、年龄、BMI、胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇比较，差异无统计学意义（P>0.05）。T2DM组空腹血糖、餐后2h血糖、糖化血红蛋白水平高于对照组，差异有统计学意义（P<0.001），见表1。

2.2  两组血浆中miR-9-3p（2-∆CT转换）表达水平

血浆miR-9-3p在T2DM组的表达水平为0.050（0.005，0.500），对照组表达水平为0.007（0.005，0.009），T2DM组血浆miR-9-3p的表达水平显著高于对照组，组间差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.3  血浆中miR-9-3p表达水平与T2DM关系的多因素分析

以是否T2DM为因变量（是=1，否=0），以血浆miR-9-3p表达水平是否升高（是=1，否=0）及上述分析中具有统计学意义的因素是否达标设定空腹血糖（<6.1mmol/L=0，>6.1mmol/L=1）；餐后2h血糖（<7.8mmol/L=0，>7.8mmol/L=1）和糖化血红蛋白（<6.0%=0，>6.0%=1）为自变量，进行多因素Logistic回归分析结果见表2。结果显示，血浆miR-124表达水平与冠心病仍然存在关系（P<0.05），血浆miR-9-3p水平升高发生糖尿病的风险显著升高，見表2。

2.4  ROC曲线分析血浆miR-9-3p对于T2DM的诊断价值

以健康人群为对照组，评价miR-9-3p对于T2DM的诊断价值，AUC=0.742，说明miR-9-3p对于T2DM诊断有一定准确性（95%CI：0.628～0.857，P=0.0005），见图1，根据约登指数最大筛选临界值为0.00985。

2.5  血浆miR-9-3p用于T2DM的诊断结果

以血浆miR-9-3p表达水平（2-∆CT转换后）大于0.00985为诊断T2DM的标准，诊断结果见表3。结果显示，血浆miR-9-3p诊断T2DM灵敏度68.085%，特异度100.000%，具有较高的真实性，并且Kappa值为0.614，诊断结果与实际结果中高度一致，具有临床应用价值。

3  讨论

miRNA是一类由非编码的单链小RNA分子组成的因子，功能是调节体内多种蛋白质类物质的表达。miRNA因子广泛的存在于机体细胞内以及全身的循环系统之中。机体处于相对稳定状态时，个体之间细胞及循环中的miRNA表达量是大致相同的，在机体出现某些特定的状态下，如生长发育、疾病，细胞中miRNA表达水平会发生变化，调节细胞功能，或细胞崩解加剧，大量miRNA释放如血浆，可以检测到血浆中miRNA量发生变化。miRNA调节蛋白质表达，血浆中miRNA的变化是要早于蛋白类标记物[8]，检测血浆miRNA表达水平能够预测疾病的发生。

miR-9-3p基因定位于15号染色体，是miRNA家族中的组成之一，首次的功能研究被认为是一种脑源性相关的miRNA，在血管性痴呆中研究显示，海马中miR-9-3p表达水平显著下调，突触相关蛋白97（SAP97）是一种众所周知的与突触功能相关的基因，在海马神经元上进行的体外实验表明，miR-9-3p负调节SAP97的表达。然而目前国外研究表明，miR-9-3p还具有调节胰岛素分泌、促进胰岛素抵抗的作用，因此miR-9-3p在糖尿病相关的研究较受关注[9-10]。miR-9-3p在调节胰岛素分泌过程中起到重要作用，如研究证实：当胰岛β细胞中miR-9-3p表达量升高时，加强其抑制胰岛素分泌的功能，机制可能是通过转录后的翻译抑制过程[11]。还有研究证实：在高糖模型中，如高血糖刺激，可以检测到胰岛β细胞中miR-9-3p显著升高，之后调控凋亡蛋白表达降低[12]。还有学者发现，相较于正常人在糖尿病患者外周血细胞中miR-9-3p表达水平也是升高的，并且糖尿病患者还存在脂代谢紊乱[13]。本研究显示与健康对照组相比，T2DM组血浆中miR-9-3p表达水平显著升高，并进一步通过ROC曲线分析血浆miR-9-3p对于T2DM的诊断价值，结果显示：以体检健康人群为对照组，miR-9-3p对于T2DM精准诊断有一定准确性。以上结果说明血浆miR-9-3p有望成为T2DM精准诊断的潜在分子标记物。

本研究证实T2DM患者血浆miR-9-3p表达水平较健康人群产生显著差异。代谢相关microRNA，miR-9-3p在病理生理过程中可能发挥促进T2DM进展的作用，本实验为T2DM精准诊治提供新型分子标记物。

4  参考文献

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[2023-01-09收稿]