二甲双胍诱导铁死亡抑制胶质瘤细胞增殖作用机制的研究

金鹏程 林 杰 朱鹏磊

胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，约占恶性脑肿瘤的81%，其5 年相对存活率不足5%[1]。最新研究发现，二甲双胍可显著改善胶质瘤患者的总体和无进展生存期，但其作用机制目前尚不明确[2-3]。铁死亡是一种由铁依赖性脂质过氧化决定的程序性细胞死亡形式，在胶质瘤中发挥抑癌作用[4]。其中膜脂过氧化物酶还原酶谷胱甘肽过氧化物酶（GPX4）利用谷胱甘肽消除磷脂过氧化物（ROS）抑制细胞铁死亡[5]。5-、12-和15-羟二十碳四烯酸（HETE）是脂质过氧化产物，与铁死亡中铁蛋白的沉积有关，是铁死亡水平的指标。链脂肪酸-CoA 连接酶（ACSL-4）是铁死亡的关键调节因子，通过促进细胞铁死亡在肿瘤中发挥抑癌作用[6]。本研究拟探讨二甲双胍通过诱导铁死亡抑制胶质瘤细胞增殖的作用和可能机制。

1 实验材料

1.1 细胞系 胶质瘤细胞系U251（TCHu 58）购自上海中科院细胞库。U87（HTB-14）、T98G（CRL-1690）、HEB（HTX2018）均购自美国ATCC 细胞库。

1.2 主要试剂与仪器 DMEM 培养液（Gibco，批号11320082）、胎牛血清（Gibco，批号10100147）和胰蛋白酶（Gibco，批号25200072），细胞计数试剂盒（CCK-8，Abcam，批号ab228554），丙二醛（MDA）试剂盒（Abcam，批号ab118970），ROS 试剂盒（Abcam，批号ab139476），乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（Abcam，批 号ab197000），5 -HETE 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（FineTest，批号EU0185），12-HETE ELISA 试剂盒（FineTest，批号EU3131），15-HETE ELISA 试剂盒（FineTest，批号EU2612），流式细胞仪（BD，型号C111186），凝胶成像仪（Bio-Rad，型号VersaDoc 3000），GPX4（CST，批号59735）、ACSL-4（Abcam，批号ab155282）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（CST，批号5174）。

2 实验方法

2.1 细胞培养和分组 U87、U251 及T98G 胶质瘤细胞用含10%胎牛血清和青霉素-链霉素组合的DMEM 培养基在37 ℃和5% CO2的细胞恒温培养箱中培养。实验细胞按实验设计分为对照组、二甲双胍组或者对照组、二甲双胍组和二甲双胍+铁死亡抑制剂（ferrostatin-1）处理组。

2.2 Western blot 检测细胞蛋白表达 使用MPERTM哺乳动物蛋白提取试剂从U87 细胞中提取总蛋白，蛋白质浓度采用BCA 法测定。将等量的蛋白质提取物和2×SDS 上样缓冲液混合并煮沸5 min。10% SDS-PAGE 分离蛋白质，然后转移到聚偏二氟乙烯膜。将膜在室温下用5%脱脂牛奶封闭2 h，然后与GPX4、ACSL-4 一抗在4 ℃下孵育过夜，清洗后将膜与辣根过氧化物酶缀合的二抗在室温下孵育2 h。使用凝胶成像系统观察并扫描蛋白质条带。

2.3 ELSIA 检测脂质过氧化产物水平 将PBS 清洗板2 次，每孔加入50 μL 标准品或样品，然后向每孔中加入50 μL Biotin-labeled 抗体，轻轻敲击板以确保充分混合，37 ℃下孵育45 min，吸出并洗涤板3次，每孔加入100 μL SABC 工作液，37 ℃孵育30 min，吸出并洗涤板5 次，加入90 μL TMB Substrate Solution，在37 ℃下孵育10～20 min，加入50 μL 终止液，读取OD 值并计算样品浓度。

2.4 MDA 试剂盒检测MDA 水平 将硫代巴比妥酸液添加到样品和标准品中，在95 ℃下孵育60 min，在冰浴中冷却10 min，转移到微孔板的孔中，用酶标仪分析MDA 水平。

2.5 流式检测细胞活性氧（ROS）含量 流式细胞仪检测细胞ROS 水平，收集处理的胶质瘤细胞，用ROS 深红染料工作溶液染色，37 ℃下孵育细胞30～60 min。流式细胞仪监测荧光强度的变化，计算ROS含量。

2.6 CCK-8 检测细胞活力 将U87 细胞以3000 个细胞/孔的密度接种在96 孔板上，细胞贴壁后，按照分组加入二甲双胍或ferrostatin-1 处理48 h，每组6个复孔，更换含有CCK-8 工作液的培养基（CCK-8工作液与培养基配制比例为1∶10），每孔100 μL，37 ℃避光孵育1.5～2.0 h，用酶标仪检测450 nm 处吸光度值。

2.7 细胞克隆形成实验检测细胞克隆形成能力 梯度倍数稀释对数生长期的各组细胞悬液，取300 个细胞分别接种于10 cm 培养皿中，二甲双胍或ferrostatin-1 处理，培养2 周。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时终止培养。弃上清，4%多聚甲醛固定，吉萨姆染色液染色，并拍照记录。

2.8 比色法检测细胞LDH 水平 将U87 细胞以5000 个细胞/孔的密度接种在96 孔板上，并进行二甲双胍或ferrostatin-1 处理，使用LDH 细胞毒性试剂盒测量LDH 水平。酶标仪测量490 nm 处的吸光度。

2.9 统计学方法 每个实验重复3 次。应用SPSS 22.0 软件（IBM Corp.）统计分析，所有数据符合HE分布以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 胶质瘤细胞铁死亡减少 ELISA 结果显示，与神经胶质细胞（HEB）比较，神经胶质瘤细胞U87、U251 和T98G 中的5-、12-和15-HETE 水平显著降低（P<0.05，P<0.01，见表1）；Western blot 显示，与HEB 比较，U87、U251 和T98G 中的GPX4 表达 增高，ACSL-4 蛋白表达降低（见图1）。

表1 HEB、U87、U251 和T98G 5-、12-和15-HETE 水平比较（）

表1 HEB、U87、U251 和T98G 5-、12-和15-HETE 水平比较（）

注：HEB 为人神经胶质细胞；HETE 为羟二十碳四烯酸；U87、U251、T98G 为胶质瘤细胞；与HEB 比较，aP＜0.05，bP＜0.01

图1 Western blot 检测正常人神经胶质细胞HEB 和胶质瘤细胞GPX4 及ACSL-4 蛋白表达

3.2 二甲双胍促进铁死亡抑制胶质瘤细胞增殖 为了研究二甲双胍对神经胶质瘤细胞的影响，以10mmol/L的二甲双胍处理神经胶质瘤细胞系U87 0、12、24和48 h，结果表明，二甲双胍处理U87 细胞，细胞活力呈时间梯度降低，LDH 释放量呈时间梯度增加（P<0.05，P<0.01，见表2）。细胞克隆实验结果表明，二甲双胍抑制胶质瘤细胞的克隆增殖能力（见图2A）；EdU 实验结果表明二甲双胍抑制胶质瘤细胞增殖（见图2B）。

图2 二甲双胍抑制胶质瘤细胞增殖

表2 二甲双胍对胶质瘤细胞活力和LDH 释放量的影响（%，）

表2 二甲双胍对胶质瘤细胞活力和LDH 释放量的影响（%，）

注：LDH 为乳酸脱氢酶；与0 h 比较，aP＜0.05，bP＜0.01

3.3 二甲双胍通过下调GPX4 和上调ACSL-4 诱导人神经胶质瘤细胞铁死亡 10 mmol/L 二甲双胍处理48 h 后，U87 细胞的MDA 水平增加，细胞活力下降（见表3）。ROS 水平增加（见图3A），GPX4 蛋白减少和ACSL-4 蛋白增多（见图3B）。

图3 二甲双胍促进胶质瘤细胞铁死亡

表3 二甲双胍对U87 胶质瘤细胞MDA 水平和细胞活动的影响（%，）

表3 二甲双胍对U87 胶质瘤细胞MDA 水平和细胞活动的影响（%，）

注：MDA 为丙二醛；与对照组比较，aP＜0.01

3.4 铁死亡抑制剂阻断二甲双胍对胶质瘤细胞的抗增殖作用 二甲双胍处理胶质瘤U87 细胞后，细胞活力下降，MDA 水平升高（P<0.01）；与二甲双胍组比较，二甲双胍联合5 mmol/L 铁死亡抑制剂ferrostatin-1 处理组U87 细胞活力升高，MDA 水平下降（P<0.05，P<0.01，见表4）。Western blot 结果表明，ferrostatin-1 抑制二甲双胍诱导的GPX4 表达水平的降低和ACSL-4 表达水平的增加（见图4A）。此外，ferrostatin-1 减弱二甲双胍诱导的ROS 水平的增加（见图4B）。与二甲双胍处理的细胞比较，ferrostatin-1 增加二甲双胍处理的人神经胶质瘤细胞的增殖活性，提高细胞活力和克隆形成能力（见图4C-4D）。

图4 铁死亡抑制剂阻断二甲双胍对人神经胶质瘤细胞的抗癌作用

表4 铁死亡抑制剂阻断二甲双胍对U87 细胞活动和MDA水平的影响（%，）

表4 铁死亡抑制剂阻断二甲双胍对U87 细胞活动和MDA水平的影响（%，）

注：ferrostatin-1 为铁死亡抑制剂；MDA 为丙二醛；与对照组比较，aP＜0.01；与二甲双胍组相比，bP＜0.05，cP＜0.01

4 讨论

研究发现，二甲双胍通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡等机制在结直肠癌和乳腺癌等多种癌症中发挥抗癌作用[7]。例如在乳腺癌中二甲双胍通过下调细胞中的转录因子Sp1 使HMGA2 启动子失活，抑制癌细胞的增殖[8]。一项Meta 分析发现，在108161 例2型糖尿病患者中二甲双胍治疗与显著降低结直肠肿瘤风险相关[9]。胶质瘤是成人中枢神经系统发病率最高的恶性肿瘤，由于其异质性和侵袭性特征，神经胶质瘤很难完全治愈[10-11]。高血糖与胶质瘤生存率降低密切相关，是胶质瘤的不良预后因素，二甲双胍治疗可延长胶质瘤患者无进展生存期（HR=0.29，95%CI=0.11～0.78）[2，12-13]。本研究探讨二甲双胍对胶质瘤细胞增殖和铁死亡的调控作用，结果表明二甲双胍处理胶质瘤细胞，铁死亡增多，细胞增殖被抑制。

铁死亡是一种由铁依赖性脂质过氧化决定的死亡模式，其特点为细胞中铁依赖性脂质过氧化物（脂质ROS）的异常积累，破坏氧化还原平衡并最终导致细胞死亡，这些过程主要由细胞内GPX4 活性丧失引起[14-15]。GPX4 是一种GSH 依赖性酶，其合成增加可减少细胞内氧化应激和抑制铁死亡，从而促进肿瘤生长[16]。ACSL-4 在脂肪酸代谢中起关键作用，ACSL-4 激活长链不饱和脂肪酸参与膜磷脂合成，引发细胞铁死亡[17]。研究发现，二甲双胍可增加细胞内Fe2+和脂质ROS 水平，诱导铁死亡并抑制乳腺癌细胞的增殖[18]。机制研究发现，二甲双胍通过上调miR-324-3p 抑制GPX4 表达诱导乳腺癌细胞铁死亡，抑制癌细胞活力[19]。已有研究证实，二甲双胍可抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭，促进其凋亡，但其具体机制尚不明确[20]。本研究发现，二甲双胍抑制胶质瘤细胞GPX4 蛋白表达，促进ACSL-4 蛋白表达，进而导致ROS 水平增加，触发铁死亡，抑制胶质瘤增殖。此外，本研究还发现抑制铁死亡后，胶质瘤细胞活力升高，进一步证实二甲双胍可能通过诱导铁死亡来抑制胶质瘤细胞增殖。