我国土霉素的淡水生物水质基准与标准及生态风险评估研究

司静宜，洪亚军,2，夏 鹏,3，白英臣*，冯承莲

1.中国环境科学研究院，环境基准与风险评估国家重点实验室，北京 100012

2.同济大学环境科学与工程学院，上海 200092

3.常州大学环境与安全工程学院，江苏 常州 213164

土霉素是一种四环素类抗生素，由于其对金黄色葡萄球菌、肺炎球菌等有较强抗菌活性，且价格低廉被广泛用于畜禽及水产养殖业[1]，高水溶性、低辛醇-水分配系数(lgKOW=—0.90)以及相对较低的酸度系数(3.27＜pKa＜9.11)决定了土霉素具有亲水性和酸稳定性.土霉素主要通过3种途径进入水体：①没有被机体吸收的土霉素(30%～90%)会以原形或代谢物的形式经尿液和粪便排出体外，直接进入水环境；②一些水产养殖用水，直接排入环境中；③部分污水进入污水处理厂，但传统手段对抗生素的去除能力有限，土霉素等污染物随着再生水或中水排放进入环境.以抗生素为代表的新污染物已引起广泛关注，美国环境保护局发布了PPCPs的相关文件，如《Contaminants of Emerging Concern in Fish: Pharmaceuticals and Personal Care Products (PPCPs)》等，意识到新污染物对水生生物及人体健康可能造成的危害，且抗生素的耐药性已经被世界卫生组织列为威胁全球健康的三大因素之一.据统计，2018年我国四环素类抗生素的使用量高达1.2×105t，如此大的使用量可能造成土霉素在环境中的残留.2014年汉江平原的地表水中土霉素的检出率为79%[2]，2013年6月海河的子牙河支流土霉素的检出浓度高达97 434 ng/L[3].研究表明，土霉素对水生生物具有较强毒性，如当土霉素暴露剂量在165.7 mg/L时，它能引起鲫鱼(Carassius auratus)肾细胞DNA的损伤，具有一定的遗传毒性[4]；对植物而言，它可以抑制青萍(Lemna minor)等植物叶绿素合成酶的活性[5]，因此开展土霉素的水质基准标准研究对保护我国淡水生物具有重要意义.

淡水生物水质基准是指水环境中的污染物质或有害因素对淡水生物及其生态功能不产生有害效应的最大剂量或水平[6].水质基准是国家制订水质标准，进行水质管理的科学依据和基石，欧美一些发达国家较早就开始了相关研究，已经建立了较为完善的理论方法体系[7]，虽然我国对水质基准的研究起步相对较晚，但进展十分迅速，我国从局部地表水或大陆地区地表水的范围来推导土霉素的水质基准，取得了系列成果，如秦延文等[1]采用评价因子法对大辽河的几种抗生素进行生态风险评价，通过毒性数据的搜集确定了土霉素的预测无效应浓度值(1.04 μg/L)；陈丽红等[8]搜集并筛选了4门10科共12个慢性毒性数据，采用毒性百分数排序法计算得到了土霉素的预测无效应浓度(4.93 μg/L).这些成果为土霉素保护淡水生物急慢性水质基准值的推导具有重要的意义.但目前我国尚未有针对土霉素的保护淡水生物标准建议值的相关研究，因此，开展土霉素的淡水生物水质基准研究对我国相关水质标准的制定起到一定的参考价值.

基于此，本研究在搜集我国本土物种毒理数据的基础上，使用物种敏感度分布法(species sensitivity method，SSD)和毒性百分数排序法(toxicity percentage ranking method，TPR)分别推导了土霉素的短期及长期水质基准，并采用风险熵值法和概率法对我国部分地表水土霉素的生态环境状况进行风险评估，为我国地表水环境土霉素的水质标准制定和对PPCPs的科学管理提供依据与参考.

1 研究方法

1.1 毒性数据及环境实测浓度的收集与筛选

作为畜禽养殖中土霉素的常用制剂，土霉素盐酸盐和土霉素钙在水中电离后，会分离出土霉素和盐类.土霉素盐酸盐易溶于水，在水产中使用较广泛，毒性略高于土霉素钙；土霉素钙能提高土霉素的稳定性，可以有效降低土霉素的残留，毒性略小于土霉素.在美国生态毒理数据库(ECOTOX)、Web of Science和中国知网等数据库中，搜索在我国广泛分布的淡水生物的毒性数据，包括土霉素、土霉素盐酸盐和土霉素钙的急性毒性数据〔半数致死浓度(LC50)、半数效应浓度(EC50)〕和慢性毒性数据〔最低观察效应浓度(LOEC)、无观察效应浓度(NOEC)、最大容许毒物浓度(MATC)〕等.在中国知网以及Web of Science中使用关键词“土霉素”“地表水”“浓度”搜索2007年1月—2022年3月间我国地表水中某月或年均的土霉素浓度值.

搜集到的毒性数据按照以下原则进行筛选：①先对物种进行筛选.依据《中国动物志》《中国生物物种名录》和《淡水生物水质基准推导技术指南》(HJ 831—2022)附录B，选择栖息或广泛分布于我国的代表性淡水水生生物，弃用有害的外来入侵种.②对试验条件进行筛选.关于暴露时间优先选择以下条件的数据，对于急性毒性数据，水生动物中溞类和摇蚊类生物为48 h左右，其他物种为96 h左右，而水生植物的暴露时间为96 h左右；对于慢性毒性数据，水生动物中，轮虫为大于等于48 h，其他动物大于等于21 d或覆盖一个敏感生命阶段；暴露方式采用流水式＞半静态＞静态的顺序进行筛选.③关于毒性数据的优先性选择，急性毒性数据通常为LC50或EC50，不区分优先性；慢性毒性数据的优先性为 MATC ＞ EC20＞ EC10= NOEC ＞LOEC ＞ EC50＞ LC50.

1.2 物种敏感度分布法

SSD法建立在不同物种对污染物产生的剂量-效应响应关系[9].首先使用统计模型，如正态分布模型、对数正态分布模型、逻辑斯蒂分布模型等对生物毒性数据的种平均值和累计概率进行拟合，依据R2最大、均方根误差(RMSE)最小的原则选出拟合程度最优的模型.而后采用SSD曲线上累积概率5%对应的浓度值，即保护生态系统95%以上物种对应的浓度(HC5)作为保护大多数物种的污染物浓度.HC5再除以AF得出短期水质基准(SWQC)和长期水质基准(LWQC).AF为评估因子，其值根据推导基准时所用的数据量、受试物种涵盖范围和数据拟合分布等情况综合确定，一般取2～5，当有效毒性数据包括的物种数量大于15时，取值为2；有效毒性数据包括的物种数量小于等于15时，取值为3[10].

1.3 毒性百分数排序法

TPR法是US EPA推荐的推导水质基准的标准方法[11]，该方法的制定包括基准最大浓度(CMC)和基准连续浓度(CCC).按照TPR法推导水质基准的要求，分别计算每个物种的种平均急性值(SMAV)、每个属的属平均急性值(GMAV)和累积概率(P)，其中SMAV和GMAV均采用几何平均法计算；将GMAV值升序排列，次序为R，选择4个累积概率(P)〔P=R/(N+1)，其中N为属的总数〕接近0.05的GMAV计算CMC.

式中：FAV为最终急性值，μg/L；CMC和GMAV分别为基准最大浓度和属平均急性值，μg/L；AF为评估因子，取值与SSD法保持一致；P为累积概率；A和S为计算中采用的中间符号，无特殊含义.CCC一般考虑污染物对水生动植物的慢性效应，与计算CMC的步骤相似[11].

1.4 生态风险评估

风险熵值法(risk quotients，RQ)[12]被广泛应用于地表水污染物的生态风险评估，RQ表示风险系数，为地表水实测的土霉素浓度与推导的长期水质基准阈值的比值.当RQ≥1时，则生态风险较高；当0.1≤RQ＜1时，污染物具有一定的生态风险；当0.01≤RQ＜0.1时，生态风险较低；当RQ＜0.01时，则目标物对水生生物无风险[13].本研究采用该方法对土霉素在我国地表水范围内检测到的土霉素进行初步的生态风险评估.

概率法是通过计算污染物的毒性效应曲线和环境实测浓度效应曲线重合部分的面积，来量化污染物的风险概率[14].首先将慢性毒性数据和土霉素地表水浓度数据进行自然对数的转换，利用Matlab(2014b)软件将二者的概率密度分布曲线绘制在相同的轴上，再计算两正态分布曲线之间的重叠面积，该面积值即表示生态风险概率.

2 结果与讨论

2.1 毒性数据的收集与筛选

经筛选，土霉素的急性毒性数据涉及轮虫动物门、节肢动物门、刺胞动物门、脊索动物门和绿藻门，共计5门10科13种(见表1).急性毒性数据中，最敏感的动物是模糊网纹溞(Ceriodaphnia dubia)，最不敏感的动物是蓝绿鳞鳃太阳鱼(Lepomis macrochirus)，二者的种平均急性值(SMAV)分别为0.18和831.6 mg/L〔见图1(a)〕，相差4 620倍；最敏感的植物是羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)，SMAV为0.34 mg/L.慢性动物数据涵盖节肢动物门、脊索动物门和被子植物门共计3门9科10种(见表2).慢性毒性数据中，最敏感的动物是虹鳟(Oncorhynchus mykiss)〔见图1(b)〕，最不敏感的动物是鲤鱼(Cyprinus carpio)，二者的SMCV分别为0.22和2 000 mg/L，相差9 000倍.而植物中对土霉素最敏感的物种是水蕴草(Egeria densa)，SMCV为0.07 mg/L.急慢性毒性数据都至少 包括10个物种，涵盖了生产者(被子植物、藻类)、初 级消费者和次级消费者等3个营养级，满足《淡水生 物水质基准推导技术指南》(HJ 831—2022)的最少毒 性数据需求.

表1 土霉素对我国淡水生物的急性毒性数据Table 1 Acute toxicity data of oxytetracycline for freshwater aquatic organisms in China

表2 土霉素对我国淡水生物的慢性毒性数据Table 2 Chronic toxicity data of oxytetracycline for freshwater aquatic organisms in China

图1 土霉素的急性、慢性动物SMAV分布雷达图Fig.1 Radar plot of acute and chronic toxicity distribution of oxytetracycline in animals

2.2 土霉素的水质基准推导

本研究使用国家生态环境基准计算软件，分别采用正态分布模型、对数正态分布模型、逻辑斯蒂分布模型、对数逻辑斯蒂分布模型对14个种平均急性值(SMAV)和10个种平均慢性值(GMAV)进行SSD模型拟合.土霉素的急慢性毒性数据经这4种模型拟合后，均能通过A-D检验，且R2最大、RMSE最小的模型为拟合效果最优的模型，其中急性毒性数据选择逻辑斯蒂分布模型，慢性毒性数据选择正态分布模型，R2分别为0.85和0.96，RMSE分别为0.103和0.054(见表3).本研究推导得出短期物种危害浓度HC5的急性毒性阈值为183.6 μg/L，慢性毒性阈值为56 μg/L(见图2)，由于最终的急慢性的有效毒性数据包含的物种数量小于15，因此AF取3，即得到最后的短期水质基准为61.2 μg/L，长期水质基准为 18.7 μg/L.

图2 土霉素的急慢性物种敏感度分布曲线Fig.2 The acute and chronic species sensitivity distribution curves of oxytetracycline

表3 土霉素的急慢性SSD分布曲线拟合结果Table 3 Summary of fitting data with acute and chronic species sensitivity distribution of oxytetracycline

基于急性毒性数据，最敏感的4个属分别是网纹溞属、月牙藻属、伪蹄形藻属和臂尾轮虫属，GMAV分别为 0.18、0.34、0.6、1.87 mg/L(见表1)，依据式 (1)最终计算得到CMC为34.0 μg/L；将慢性动物毒性数据按照GMCV进行升序排列，最敏感的4个属分别是水蕴草属、太平洋鲑属、浮萍属和真鮰属，GMCV分别为 0.07、0.22、1.0、3.0 mg/L(见表2)，最终计算得到 CCC 为 7.4 μg/L.

2.3 基准推导结果对比

本研究采用TPR法推导出的CCC是陈丽红等[8]研究结果(4.93 μg/L)的2.3倍，但陈丽红等[8]采用SSD法推导的长期水质基准(22.8 μg/L)是本研究结果的1.2倍.陈丽红等[8]依据化学物质风险评价技术指导文件，搜集了包括鲤鱼(Cyprinus carpio)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)等10种动物数据和近头状伪蹄形藻(Pseudokirchneriella subcapitata)、水蕴草(Egeria densa)2种植物数据，推导用到的4个敏感属分别为水蕴草属、小球藻属，真鮰属和鲷属，GMCV分别为0.02、0.6、3.0和4.0 mg/L.本研究的CCC推导和陈丽红等[8]选取的敏感属都包括动物和植物，其中最敏感的属都是水蕴草属，数据来源相同，但本研究加入了来自同一篇文献的值为0.25 mg/L的毒性数据，原因是两个暴露浓度下的效应终点均表现为水蕴草(Egeria densa)的生长抑制，增加物种的数据量，使基准推导更具有科学性.真鮰属则采用的是相同的数据.此外，本研究的植物数据加入我国本土敏感的淡水水生植物—浮萍属的毒性数据，而敏感动物涵盖了脊索动物门和节肢动物门，营养级涉及范围更广，体现了本研究用于基准推导的毒性数据具有一定的科学性和可靠性.

两种基准推导法的结果表明，SWQC为CMC的1.8倍，LWQC约为CCC的2.5倍(见表4).TPR法推导出的水质基准阈值对淡水生物的保护范围更大，但由于依赖敏感物种的毒性数据，在实际应用中可能存在“过保护”现象，增加环境管理的负担和经济成本，甚至造成资源浪费，并且我国的水质基准推导方法侧重于SSD法[30]，因此本研究选择SSD法推导的短期及长期水质基准值(分别为61.2和18.7 μg/L)作为最终的基准推荐值.

表4 TPR和SSD法推导结果对比Table 4 Comparison of water quality criteria of oxytetracycline derived by TPR and SSD methods

2.4 我国部分地区地表水中土霉素的生态风险评估

通过文献搜索，共获得2007年1月—2022年3月的长江、黄河和海河等7个流域地表水中不同季节的803条土霉素水环境浓度数据，我国部分地区地表水土霉素的浓度变化范围较大，介于0.1～97 433.8 ng/L之间.从空间上整体来看，北方流域地表水中的土霉素检出浓度高于南方.在各采样点中，海河流域的子牙河支流(石家庄段)地表水的检出浓度最高，为97 434 ng/L，在各流域中，松花江辽河流域地表水中土霉素检出浓度的平均值最高，为57.35 ng/L，海河流域地表水中土霉素检出浓度的平均值次之，为42.86 ng/L.北运河和清河地表水中土霉素在冬夏两季的检出浓度也处于相对较高水平，超过400 ng/L.长江流域地表水中土霉素检出浓度的平均值为10.53 ng/L，各采样点土霉素的环境浓度差距大，其中贵阳南明河和太湖连接长江的支流地表水中土霉素的检出浓度均在2 000 ng/L以上，而长江口地表水中土霉素的检出浓度仅为0.1 ng/L，其浓度之差在20 000倍以上；黄河流域、珠江流域和东南部流域地表水中的土霉素平均检出浓度处于同一水平，在6.5～10 ng/L之间，其中珠江流域最低，为6.56 ng/L.内陆河流域仅搜集到新疆赛里木湖的8个采样点土霉素的检出浓度，平均值为15.9 ng/L(见表5).

表5 七个流域地表水中的土霉素浓度Table 5 The concentrations of oxytetracycline in surface water of seven river basins

续表5

7个流域土霉素的最大检出浓度均低于短期水质基准值，表明地表水中的土霉素不会对淡水生物造成急性毒性影响，而个别地区的土霉素浓度超过或接近长期水质基准值，这些地区的土霉素含量可能对部分淡水生物产生慢性毒性影响.风险熵值法分析结果显示，除了海河流域的子牙河支流(石家庄段)对淡水生物存在较高的生态风险外，其余采样点地表水的实测浓度均低于长期水质基准值.7个流域的RQ介于5.35×10—6～5.21之间，其中子牙河支流(石家庄市)的RQ值最高，该暴露浓度下，水蕴草(Egeria densa)最先受到土霉素的毒性影响.进一步统计发现，长江流域的贵阳南明河、太湖连接长江的支流的RQ值均为0.12，表明这2个区域的土霉素对淡水生物具有一定的生态风险；洪湖周边河流，海河流域的北运河和清河RQ值介于0.01～0.1之间，处于较低的生态风险，其余地区地表水的土霉素浓度对淡水生物基本无生态风险，这初步表明我国地表水中土霉素对淡水生物的影响较小，但部分地区仍具有一定的生态风险(见表5).

由于内陆河流域的采样点数量非常有限，数据无法通过正态分布检验，因此概率法并不适用，因此本研究使用概率法对其他6个流域地表水的土霉素浓度数据进行生态风险评估.首先，将我国搜集到的这6个流域的地表水与急、慢性毒性数据进行概率法分析，得到的概率面积分别为0.253和0.364(见图3)，表明淡水生物受到土霉素慢性毒性影响的可能性更大.6个流域的慢性毒性风险概率范围为0.082～0.427，各流域慢性毒性的风险概率排序为海河流域＞长江流域＞东南部流域＞黄河流域＞松辽河流域＞珠江流域.

图3 我国6个流域的土霉素风险评估Fig.3 Risk assessment of oxytetracycline in six regions in China

我国现行《地表水环境质量标准》(GB 3838—2002)中未对土霉素做出规定，但在GB 3165—2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》中有明确标准，如家禽的肌肉组织中土霉素的残留限值为200 μg/kg.美国1989年发布以土霉素、土霉素盐酸盐、土霉素钙复合物为活性成分的农药产品注册指南，对土霉素及其制剂的用量提出建议值，如儿童的正常使用剂量为25～50 mg/kg，但未发布过土霉素的水环境质量标准值；澳大利亚、新西兰及欧盟等国家和组织也并未对土霉素的水质基准进行建议值的发布.综合上述水质基准推导过程及对我国部分流域土霉素的风险评估结果，提出我国保护淡水生物的地表水环境质量标准建议值为18.7 μg/L.

虽然本研究的毒性数据筛选、基准阈值推导方法和生态风险评估过程借鉴我国指南文件及已有研究，但仍存在不确定性.首先，生物毒性数据可能因为筛选原则的不同而变化，进而影响基准阈值的结果，不同地域的同种生物在药物耐受上也可能存在差异，后续计划利用本地种开展试验，对搜集的数据及基准推导进一步验证；其次，土霉素的淡水生物毒性可能不同程度地受pH、溶解有机质、温度等水质参数的影响，目前的研究尚不能对这些因素的影响进行定量校正；此外，土霉素的地表水环境暴露数据时间跨度为15年，具有时效性，且需要进一步搜集淮河及西南地区地表水中土霉素环境浓度的监测数据，以综合评判我国地表水的风险情况.

3 结论

a) 土霉素的急性毒性数据涉及轮虫动物门、节肢动物门等5门10科13种，慢性动物数据涵盖节肢动物门、脊索动物门等3门9科10种；采用物种敏感度分布法得到SWQC和LWQC分别为61.2和18.7 μg/L，采用毒性百分数排序法得到CMC和CCC分别为 34.0 和 7.4 μg/L.

b) 我国地表水中土霉素的浓度对淡水生物的风险总体较低，但部分地区仍存在一定的生态风险.海河流域的子牙河支流(石家庄段)地表水生态风险最高，长江流域的贵阳南明河及太湖连接长江的支流地表水具有一定的生态风险.7个流域的总慢性毒性风险概率为0.364，其中海河流域风险最大(0.427)，珠江流域最小(0.082).

c) 综合考虑物种敏感度分布法和毒性百分数排序法这两种基准推导方法的特点及在我国的适用性，建议我国保护淡水生物的土霉素地表水环境质量标准值为 18.7 μg/L.