女贞子精油的提取工艺及其抑菌抗氧化活性

刘艳红，翟辛敏，李二娇，张滕，彭汝月，朱明慧，赵胡

(1.阜阳师范大学 信息工程学院，安徽 阜阳 236000；2.阜阳师范大学 生物与食品工程学院，安徽 阜阳 236000)

女贞子，又名女贞实和冬青子，是木犀科植物女贞的果实，分布于我国东部、南部、西南部及中部各地[1]。研究表明，女贞子具有抗癌[2-3]、抗炎[4]、抗骨质疏松[4]、降低血糖和血脂[5]、调节免疫[5]、保肝[3,6]、护肾[6]、抗氧化[7]、延缓衰老[7]等作用。女贞子含有多种化学成分，主要是萜类、挥发油、黄酮类、苯乙醇苷类、多糖等，其中女贞子精油中含有丰富的不饱和脂肪酸[8]。因此，女贞子具有较高的营养价值和药用价值。

目前，植物精油的提取方法有压榨法、水蒸气蒸馏法、溶剂浸提等传统提取法，还包括超临界CO2萃取法（SFE-CO2）、分子蒸馏法（MD）、微波辅助提取法（MAE）和超声波萃取法（UAE）等新型提取技术[9-10]。其中压榨法工艺简单，能有效避免热敏性物质的损失，但所得提取物纯度不高，保存时间短[10]。水蒸气蒸馏法提取成本低，适用于难溶或不溶于水且挥发性好的精油的提取和分离，可是存在高温破坏精油热敏性成分的缺点[10]。溶剂浸提法具有操作方便，降低能耗的优点，但是有机溶剂沸点较低，易挥发，有易燃易爆的危险[11]。SFE-CO2法具有环保节能、选择性高和溶解能力可调的优点，但该法操作成本较高[9,11]。MD 法加热时间短，提取温度低，产品质量和产率高，但是对设备技术要求高，生产能力有限[12]。MAE 法可以加快提取速度，缩短提取时间，同时还可以节省溶剂，提高得率，但精油易变性失活[9,12]。UAE 法是利用超声波的空化效应，破坏植物细胞结构，使溶剂进入细胞，加速提取工艺的进程，降低提取时间[13]，该法具有提取温度低，耗时短，节能高效，提取率高等优点。近年来，超声波萃取法在天然产物提取工艺中的应用越来越广泛，常被应用于植物精油的辅助提取，且多种方法联合使用能克服单一方法的缺点，也是未来精油业发展的主要趋势[11]。

在研究的基础上将超声波萃取技术与石油醚冷提技术相结合，以期弥补单一提取法的缺点，解决精油提取率低和提取温度过高的问题。旨在通过探究超声波辅助石油醚浸提技术提取女贞子精油的最优工艺参数及其所得精油的抑菌效果和抗氧化活性，为女贞子资源的综合利用和新型食品抗氧化剂和果蔬保鲜剂及抑菌药物开发提供理论基础。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

女贞子采摘于阜阳师范大学信息工程学院校内女贞子树，大肠杆菌(Escherichia coli,或E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,或S.aureus)均为实验室保存菌种。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 试验仪器

无线触摸式超声波细胞粉碎仪（SCIENTZ-950E），宁波新芝生物科技股份有限公司；落地式高速冷冻离心机（H5-25KR），湖南可成仪器设备有限公司；冷冻干燥机，北京博劢行仪器有限公司；分析天平，上海越平科学仪器有限公司；数显恒温水浴锅（HH-4J），金坛市杰瑞尔电器有限公司；旋转蒸发器（RE-52），上海亚荣生化仪器厂；循环水式多用真空泵（SHZ-D（III）），河南省予化仪器有限公司；双人单面水平敞开式净化工作台（SW-CJ-1Cu），苏州智能净化设备有限公司；生化培养箱（BPC-250F），上海一恒科学仪器有限公司。

1.2.2 试验试剂

石油醚（沸点60～90 ℃)，西陇科学股份有限公司；三氯乙酸、过二硫酸钾（过硫酸钾）、无水三氯化铁，国药集团化学试剂有限公司；LB 肉汤，北京奥博星生物技术有限责任公司；LB 琼脂，杭州百思生物技术有限公司；抗坏血酸，上海展云化工有限公司；无水乙醇；磷酸盐缓冲液（pH 7.2），杭州微生物试剂有限公司；铁氰化钾，上海埃彼化学试剂有限公司；2,2-联苯基-1-苦基肼基（DPPH）、2,2' 氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐（ABTS），阿拉丁试剂（上海）有限公司；以上试剂均为分析纯。

1.3 女贞子精油提取

1.3.1 材料预处理

采摘生长状况良好的女贞子果实，剔除未成熟及破烂果实。去除柄与叶，用清水冲洗数次，除去灰尘。自然晾干2～3 h 后，进行冷冻干燥48 h。将冷冻干燥后的样品用粉碎机破碎，过60 目筛，除去果皮和果核后称重备用。处理好的样品装入密封袋中，于4 ℃冰箱中保存。

1.3.2 女贞子精油提取工艺流程

图1 女贞子精油提取工艺流程图Fig.1 Process flow chart of essential oil extraction from Ligustrum lucidum

1.3.3 女贞子精油的提取方法

准确称取女贞子粉10 g 置于150 mL 烧杯中。按料液比1∶5（g/mL）沿杯壁向烧杯内加入石油醚50 mL。在超声波细胞粉碎仪中于200 W 粉碎10 min。取出放置于通风橱内静置沉淀3 h，然后取上清液，在4 ℃下4000 r/min，离心15 min。将离心后的上清液混合到蒸馏烧瓶中，在65 ℃旋转蒸发仪中蒸发至一定量，转移至EP 管中。然后于85 ℃水浴锅上蒸发至石油醚完全挥发。最后称重，计算女贞子精油提取率，同时收集女贞子精油并存放于4 ℃或-20 ℃冰箱内备用。

1.3.4 女贞子精油提取率的计算

准确称取女贞子粉10 g，记为m1，经超声波处理与石油醚浸提后，离心取上清液旋转蒸发，此时，称量EP 管重，记为m2，旋转蒸发结束后收集女贞子精油与石油醚混合物，置于水浴锅上蒸发至石油醚完全挥发，再次称重，记为m3。提取率的计算式为

1.4 女贞子精油提取的单因素试验设计

在查阅文献[11,13]及预实验的基础上，以女贞子精油的提取率为指标，分别选取料液比（g/mL）为1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7，超声波功率50、100、200、300、400 W，浸提时间为0.5、1、3、5、7 h 三个因素为变量，进行单因素实验。

1.5 女贞子精油提取的正交试验设计

基于单因素试验结果，运用L9(33) 正交表，以女贞子精油提取率为评价指标，选择料液比（A）、超声波功率（B）、浸提时间（C）做三因素3 水平试验，每组试验平行操作3 次，取每组平均值作为最终提取率。因素水平设计见表1。

表1 L9(33)正交试验设计Tab.1 Orthogonal experimental design of L9(33)

1.6 女贞子精油的抑菌实验方法

采用滤纸片扩散法[12,14]，选择金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为试验菌，女贞子精油经过滤除菌后收集备用，将杀菌过的滤纸片浸泡在女贞子精油中3 s 左右，取出滤纸片放在接种试验菌的平板上，37 ℃培养，24 h后观察抑菌圈，并用游标卡尺每隔24 h 测量一次抑菌圈直径。

1.7 女贞子精油的抗氧化实验方法

1.7.1 女贞子精油总还原能力的测定

参照郭冬云等[14]的方法稍作修改。以抗坏血酸作为对照，以蒸馏水调零，测定不同质量浓度的处理样品在700 nm 波长处的吸光度，并平行测定3 次。吸光度越大表示其还原力越强。

1.7.2 ABTS 自由基清除能力的测定

参照文献[17]方法，并在此基础上做适当改进。以抗坏血酸作为对照。ABTS 自由基清除率计算式为

式中：Ai为样品吸光度；Aj为等体积Vc对照；A0为等体积蒸馏水。

1.7.3 DPPH 自由基清除能力的测定

参照罗亚飞等[15]的方法，以抗坏血酸做为对照，并用无水乙醇调零。

式中：Ai为样品吸光度；Aj为等体积Vc对照；A0为等体积蒸馏水。

1.8 数据分析

各实验平行重复3 次，取平均值，实验数据由Excel 2019 软件处理分析。

2 试验结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 料液比对女贞子精油提取率的影响

由图2 可知，女贞子精油提取率随料液比的增大呈先升高后下降最后趋于平缓的趋势，且在料液比（g/mL）为1∶5 时达到最大，为6.18%。分析原因可能是因为当料液比增大时，其传质推动力也随之增加，会加大女贞子精油从植物细胞扩散到液相中速度，但当料液比增大到一定程度后，传质推动力将不再增加，女贞子精油提取率趋于下降[16-18]。因此，料液比（g/mL）为1∶5 时，女贞子精油的提取效果较好。

图2 料液比对女贞子精油提取率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of essential oil of Ligustrum lucidum

2.1.2 超声波功率对女贞子精油提取率的影响

由图3 可知，在超声波功率50～200 W 范围内，女贞子精油提取率逐步上升，且幅度较大。在200 W 时，获得最大提取率为6.83%。在200～400 W 时女贞子精油提取率逐步下降。经过分析，这可能是因为超声波功率的增加，使得机械剪切作用和空化作用增强，分子扩散速度也随之提高，促进女贞子精油的提取[19]。但是，当继续增加超声波功率时，功率过高会使得空化作用持续增强，缩短女贞子原料在超声场中的停留时间，降低了水溶剂渗透到女贞子原料组织内部的几率，从而使得女贞子精油提取量趋于平衡，对应的女贞子精油提取率下降[19]。因此，当超声波功率200 W时，女贞子精油提取率最高。

图3 超声波功率对女贞子精油提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of essential oil of Ligustrum lucidum

2.1.3 浸提时间对女贞子精油提取率的影响

由图4 可知，石油醚浸提的时间在0.5～3 h 内，女贞子精油提取率随浸提时间增加呈增高趋势，当浸提时间为3 h 时，提取率最高达6.27%。超过3 h 时后提取率逐渐下降，在5～7 h 提取率趋于平衡。这是因为在提取初期，原料中的女贞子精油含量较高，固液间的浓度差较大，因此扩散驱动力也比较大，使得油脂分子能够不断地扩散到溶剂中，从而使提取率不断增大[20]；但随着提取时间延长，溶剂中的女贞子精油逐渐趋于饱和，溶液体系的渗透压也逐渐趋于平衡，女贞子精油提取量不再增加，相对应的提取率反而下降[20]。因此，在浸提时间为3 h 时，女贞子精油的提取效果最好。

图4 浸提时间对女贞子精油提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on the extraction rate of essential oil of Ligustrum lucidum

2.2 女贞子精油提取的正交试验结果及分析

由表2 正交试验结果分析可知，正交试验最佳组合为A2B2C2，同时结合单因素试验结果，确定女贞子精油提取的最佳工艺参数为料液比1∶5，超声波功率200 W，溶剂浸提时间3 h。由极差分析可得，各因素对女贞子精油提取率的影响程度由强到弱的顺序依次为B＞C＞A，即超声波功率（W）对女贞子精油提取率的影响最大，其次是溶剂浸提时间，最后是料液比的影响最小。

表2 正交实验结果与分析Tab.2 Orthogonal experiment results and analysis

2.3 验证实验

其他条件不变，在料液比1∶5，超声波功率200 W，溶剂浸提时间3 h 的条件下提取女贞子精油，得女贞子精油提取率为5.673 %，高于正交试验组水平，与正交实验结果吻合。

2.4 女贞子精油抑菌活性试验结果分析

如表3 所示，女贞子精油对大肠杆菌及金黄色葡糖球菌均具有抑制效果。其中女贞子精油对大肠杆菌的抑菌圈直径平均为（7.07±0.81）mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径平均为（6.72±0.54）mm。这与何新蕾[21]利用水酶法提取的女贞子精油对细菌有抑制效果的结论相吻合。

表3 女贞子精油抑菌试验结果与分析Tab.3 Antibacterial test results and analysis of Ligustrum lucidum essential oil

2.5 女贞子精油的抗氧化活性测定结果与分析

2.5.1 女贞子精油总还原能力的测定结果与分析

还原剂通过还原性作用，可以给出自身电子，达到清除自由基的目的，例如维生素C 还原剂的还原能力越强，其抗氧化能力就越强[22-24]。

如图5 所示，在实验质量浓度范围内，女贞子精油具有一定的还原能力，整体趋势是随着提取物质量浓度的增加，其还原能力逐渐上升。整体上看，女贞子精油的还原能力弱于抗坏血酸的还原能力[25]（样品组与抗坏血酸组均稀释10 倍）。

图5 女贞子精油总还原能力测定结果与分析Fig.5 Measurement results and analysis of total reducing capacity of essential oil of Ligustrum lucidum

2.5.2 女贞子精油清除ABTS 自由基能力的测定结果与分析

由图6 可知，女贞子精油具有一定的清除ABTS自由基的能力，其清除能力与样品浓度有关[26-28]。当样品质量浓度为30.64 mg/mL 时，女贞子精油的ABTS 自由基清除率为66.1%。当女贞子精油的质量浓度增加到61.28 mg/mL 时，女贞子精油的ABTS 自由基清除率达到76.8%。但其整体的ABTS 自由基清除率要低于对照组抗坏血酸的整体水平。

图6 ABTS 自由基清除率的测定结果与分析Fig.6 Measurement results and analysis of ABTS free radical scavenging rate

2.5.3 女贞子精油清除DPPH 自由基能力的测定结果与分析

由图7 可知，女贞子精油对DPPH 自由基的清除率与精油质量浓度呈现明显的量效关系[29-31]。当精油质量浓度增大时，女贞子精油对DPPH 自由基的清除效果也随之增加。以抗坏血酸做为参考可知，女贞子精油在一定浓度范围内对DPPH 自由基的清除能力较高。当女贞子精油质量浓度高于15.32 mg/mL 后，其对DPPH 自由基的清除率趋于平缓，且当女贞子精油质量浓度为61.28 mg/mL 时，其对DPPH 自由基的清除率为97.8%，超过抗坏血酸对DPPH 自由基的清除率的平均水平94%。

图7 DPPH 自由基清除率的测定结果与分析Fig.7 Measurement results and analysis of DPPH radical scavenging rate

3 结论

超声波辅助有机溶剂浸提女贞子精油的最佳工艺参数为料液比1∶5，超声波功率200 W，溶剂浸提时间3 h。在此条件下，女贞子精油的提取率为5.673 %。且影响女贞子精油提取率的因素主次顺序依次为：超声波功率＞浸提时间＞料液比。

女贞子精油粗提物对大肠杆菌和金黄色葡糖球菌均有一定的抑制效果，且具有较高的还原能力。当女贞子精油粗提物质量浓度为61.28 mg/mL 时，其对ABTS 自由基和DPPH 自由基的清除率分别达到76.80%和97.80%。