基于网络药理学和分子对接研究红花治疗阿尔茨海默病的作用机制

谭冬娴，陈棉海，郭晋言，黄一兴，肖越，陈倩文，周玉其，张维炊，杜以宽，杨春✉

（1.广东医科大学东莞市干细胞与再生组织重点实验室，广东 东莞 523808；2.东莞市人民医院，广东 东莞 523059）

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）又称老年痴呆症，由肾精亏虚、气血亏虚的本虚，与痰和瘀的标实引起，属虚实夹杂之症，临床上可通过服用补虚药、活血化瘀药等来促进治疗，如六味地黄丸、健脾养心益智汤等［1］。红花（CF），别名红蓝花，入心、肝经，属菊科，红花属植物，有活血通经、散瘀止痛的功效。药理研究发现其具有改善Aβ沉积、炎性损伤、氧化损伤与扩张血管改善微循环等作用［2-3］。红花为活血化瘀药，临床上常用于治疗由微循环障碍引起的疾病，如脑梗死、冠心病、阿尔茨海默病等［4-6］。含有红花的复方制剂如癫狂梦醒汤、镇肝熄风汤、二十五味珊瑚丸等在临床治疗AD中卓有成效，但由于其成分靶点众多，很难确定其具体机制。单味药使用的红花注射液对脑部疾病也有一定疗效，因此对红花本身的潜在作用机制进行研究，有助于更好地处理红花临床常用剂量、配伍及量效之间的关系［7-10］。本文运用网络药理学的方法对红花的有效成分及红花与AD的靶点进行预测与分析，以期为临床上应用红花治疗AD提供研究基础。

1 研究方法

1.1 红花活性成分的筛选

通过查阅文献和TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）获取红花活性化学成分。基于药代动力学参数对红花的活性成分进行筛选，以化合物的口服生物利用度（OB） ≥ 30%、化合物的类药性（DL） ≥ 0.18作为筛选条件，并通过文献收集补充红花有效成分［11］。

1.2 红花靶点的获取

将收集到的活性成分导入PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中，以复合最佳匹配为条件搜索，收集化合物2D结构。以SDF格式导入Swiss Target Prediction数据库（http：//www.swisstargetpre diction.ch/）中，将数据下载到Excel表中，以Possibility ＞ 0为条件筛选并去除重复值，得到红花的成分靶点。利用Uniprot数据库（http：//www.Uniprot.org）中的Uniprot KB检索功能对基因进行标准化后归纳整理。

1.3 AD相应靶点的获取

在OMIM数据库（http：//www.omim.org/）和GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）中，以“Alzheimer's disease”为关键词检索AD相关的基因，分别从OMIM、GeneCards数据库中获取信息，合并数据。

1.4 “药物－成分－靶点”网络构建

红花活性成分的分子式分别由CF1～CFn表示（CF为红花的英文缩写），将红花成分和作用靶点运用Cytoscape 3.7.2软件构建“药物－成分－靶点”网络。在网络中，活性成分与蛋白靶点由节点（node）表示，节点之间相连的为边（edge）。根据介度（betweenness centrality，BC）、紧密度（closeness centrality，CC）以及连接度（Degree）的中位数分析红花发挥治疗AD作用的核心靶点。

1.5 PPI网络构建

在Jvenn网站（http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）中导入红花和AD的靶点基因，获得交集基因并用韦恩图展示。将交集基因导入STRING数据库（https：//string－db.org/）中，以“HOMO SPAINS”为条件进行搜索，选择0.40和0.70分别作为红花的中度相关阈值与高度相关阈值，将结果中的Node1、Node2导入Cytoscape 3.7.2软件，使用Network Analyzer工具进行拓扑学分析计算，构建“蛋白-蛋白相互作用”（Protein－protein interaction，PPI）网络，根据BC、CC以及Degree值的中位数来预测红花治疗AD的靶点互作网络核心。

1.6 红花治疗阿尔茨海默病的通路富集分析

基因本体论（GO）分析、京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析可以提供靶点基因的基因表达数据和系统可视化信息。本研究利用DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）进行GO分析和KEGG功能注释和富集分析，在微生信工（http：//www.bioinformatics.com.cn/）中以“P≤ 0.05”的条件，并根据生物学信息筛选出显著富集的生物学注释，绘制GO分析图与KEGG分析气泡图，用于预测红花治疗AD的通路。

1.7 红花活性成分－靶点分子对接

利用LEDOCK分子对接软件，将红花中活性成分与位于网络分析中的核心靶点进行分子对接验证，以探究活性成分与核心靶点的结合程度。

2 结果

2.1 红花活性化学成分筛选

在TCMSP数据库共收集到189种成分。基于ADME参数（OB） ≥ 30%、（DL） ≥ 0.18条件初步筛选中药成分，得到22个成分。经PubChem数据库检验有20种活性成分入选，研究表明［11］，羟基红花黄色素A（Hydroxysafflor yellow A，HSYA）是红花的重要成分，TCMSP数据库无羟基红花黄色素A的数据，因此在PubChem数据库搜索Hydroxysafflor yellow A，得到成分信息（其Molecule ID为Compound CID： 6443665），将其补充纳入。对每一个化合物进行编号，包括黄酮、生物碱、有机酸类、甾族类等成分，总计21种活性化学成分，见表1。其中Molecule ID是成分的身份信息，Molecule name是成分的化合物名称，Component number代表成分用红花的英文缩写进行排序的编码。

表1 红花的21个活性化学成分

2.2 红花活性成分对应的靶点

将筛选出的21个成分导入PubChem数据库，收集化合物的2D结构。以SDF格式导入到Swiss Target Prediction数据库，获取并筛选出红花有效成分靶点839个，去除重复值得到391个靶点。

2.3 阿尔茨海默病相关靶点

以“Alzheimer's disease”为关键词，在OMIM数据库搜索，点击options选择OMIM，点击*GENE WITH KNOWN SEQUENCE（*代表基因），再次搜索得到198个基因；在GeneCards数据库中搜索并导出到Excel表提取Gene Symbol中Relevance Score ＞ 0的基因，得到535个基因，合并数据信息并剔除重合基因，最终得到608个与AD相关的靶点信息。

2.4 红花有效成分靶点网络的构建与分析

通过Cytoscape 3.7.2软件构建“药物－成分－靶点”的PPI网络。绿色方形代表红花，蓝色菱形代表红花的活性化合物，青色八边形代表靶点基因，见图1。该网络共有419个节点（1个药物节点，21个有效成分节点和397个靶点节点）和1 303条边。经Network Analyzer计算PPI网络（见表2），BC和CC中位数分别为0.000 092 57和0.300 935 93，Degree值中位数2倍为4。核心节点需要满足以上参数的中位数卡值。分析发现木脂素（lignan）、Kinobeon A的值较大；其次是除虫菊酯Ⅱ（Pyrethrin Ⅱ）、6－羟基柚皮素（6－Hydroxynaringenin）等，这些参数较高的关键有效分子提示可能在红花治疗AD的药理功能发挥相对重要的作用。

表2 21个红花化学成分的网络拓扑值

图1 红花的“药物－成分－靶点”网络图

2.5 红花活性成分－靶点－阿尔茨海默病网络构建与分析

将红花成分靶点与AD的靶点导入Excel中，获得交集靶点。进一步通过在线可视化作图网站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）绘制韦恩图，分析红花成分靶点与AD之间的靶点交集，见图2。发现红花成分靶点与AD之间有94个共同靶点，常见靶点为AKT1、CASP3、TNF、MAPK3、APP、SRC、MAPK8、EGFR、PTGS2和MTOR。

图2 红花成分靶点与阿尔茨海默病靶点的韦恩图

将上述94个靶点上传到STRING数据库中，绘制红花治疗AD的蛋白互作（PPI）网络，并通过Cytoscape 3.7.2软件进行可视化分析。节点的大小和颜色与Degree值呈正相关，Degree值越大，节点越大，颜色越深，表明靶点在此网络关系越重要。以0.4为阈值的PPI网络（见图3），通过Cytoscape 3.7.2软件计算得到BC ≥ 0.003 295 94、CC ≥ 0.522 471 911及Degree ≥ 34（中位数2倍），筛选出核心靶点AKT、CASP3、MAPK3、TNF、APP、MTOR、MAPK8等，位于网络中心且总体得分较高（见表3）。进一步研究通过构建以0.7为阈值的PPI网络来计算共同靶点基因（见图4），删除未连接的节点得到BC ≥ 0.004 922 21、CC ≥ 0.394 559 855以及Degree ≥ 12（中位数2倍），该网络显示APP、AKT、MAPK3、MAPK8位于网络的中心。在红花治疗AD的作用靶点位于中心位置的结果提示其可能在红花的药理作用中发挥重要作用。

图3 0.4阈值下的PPI网络

图4 0.7阈值下的PPI网络

表3 核心靶点在蛋白－蛋白相互作用网络中的拓扑值

2.6 红花有效成分靶点的功能通路注释

本研究中共富集535个GO条目，选取P值最小的前15个GO条目作图（其中P＜ 0.05），见图5。Y轴代表GO条目，X轴和条形图面积大小代表目标基因集中属于GO的基因数量。在生物过程（BP）中，共同靶点主要富集于对药物的反应、蛋白质磷酸化的正调控、蛋白质自磷酸化、肽基酪氨酸磷酸化、ERK1和ERK2级联的正调控等。在细胞组分（CC）中，共同靶点主要富集于线粒体、细胞质核周区、受体复合物、细胞质和质膜等。在分子功能（MF）方面，共同靶点主要与蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、酶结合、ATP结合及激酶活性等有关。

图5 GO生物过程分析

KEGG通路富集共获得43条富集通路，根据P值最小的前10个通路结合生物学注释筛选绘制气泡图（见图6）。Y轴代表Pathway名称，X轴和气泡面积大小代表目标基因集中属于该条信号通路的基因数量，气泡颜色代表富集显著性，即P值的大小。这些常见靶点在阿尔茨海默病、ErbB信号通路、5－羟色胺能突触、癌症中的蛋白多糖、肿瘤坏死因子信号通路、催乳素信号通路、百日咳、神经营养素信号通路、癌症的途径、膀胱癌中富集。使用这一系列实际测试的分析，可以提供有价值的信息，解释红花治疗AD可能的机制。

图6 KEGG通路富集分析

2.7 红花核心成分－靶点分子对接结果

以蛋白质相互作用中程度得分较高的10个核心靶点与红花核心成分进行分子对接，获得对接得分Score，见表4。一般认为Score值 ＜ -5 kJ/mol表示化合物与靶点之间有较好的结合活性。分子对接结果表明核心化合物木脂素（lignan）、Kinobeon A、除虫菊酯Ⅱ（PyrethrinⅡ）和6－羟基柚皮素（6－Hydroxynaringenin）与APP、AKT、MAPK3、MAPK8的Score均 ＜ -5 kJ/mol，说明核心化合物与核心靶点之间有较好的结合活性。获得分子对接模式见图7。

图7 成分－靶点对接相互作用模式图

表4 分子对接结果

3 讨论

血管假说提出，血管危险因素会破坏正常的脑血流动力学，进一步引起与神经炎症密切相关的氧化应激，长此以往导致β淀粉样蛋白（Aβ）清除率下降，造成Aβ沉积，而这又进一步促进氧化应激和神经炎症，加剧AD进程［12］。研究认为，动脉狭窄、动脉硬化以及微血管功能障碍等血液循环系统疾病能促使Aβ生成增加，因此与AD的发展密切相关［13］。《血证论》中指出：“凡心有瘀血，亦令健忘血在上则浊蔽而不明矣。凡失血家猝得健忘者，每有瘀血”。这些提示了治疗AD可以采用活血化瘀药物，而红花是典型的活血化瘀、改善微循环的良药，红花复方剂健脑散、涤痰汤加减等就用于治疗AD［14-15］。

本研究中，笔者筛选出21个红花活性成分，羟基红花黄色素A（HSYA）被认为是红花的重要成分，因此也将其补充纳入［11］。槲皮素可以下调IL－6、IL－1β、TNF－α、COX－2、iNOS的基因表达，改善淀粉样前体蛋白/早老素1（APP/PS1）小鼠的学习记忆能力与炎症反应［16］。山柰酚可以抑制Caspase－3、Caspase－9以及AchE活性，抑制Aβ诱导的ROS的产生，减轻AD果蝇的神经毒性运动与认知障碍［17］。这表明红花成分可以通过减缓神经炎症与氧化应激发挥保护脑组织的作用。KEGG显示神经营养素信号通路与阿尔茨海默病信号通路中富集较多关键靶点。有研究表明，木脂素在OBX小鼠海马组织中诱导神经营养因子相关的信号转导通路包括蛋白激酶B（Akt）、细胞外信号调节激酶（ERK）和环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB），通过促进神经营养因子通路相关的细胞内信号传导水平来发挥治疗作用［18］。木犀草素既可以上调海马脑源性神经营养因子（BDNF）表达和激活Akt、ERK和CREB信号通路营养神经元，也可以通过阻断核因子κB（NFκB）和激活蛋白－1（AP－1）信号通路以及下调Toll样受体4和5在大鼠脑组织中的表达来发挥抗炎作用［19-20］。由此可见，红花的有效成分可通过Akt途径对神经营养素信号通路起调节作用。HSYA不仅可能通过血小板衍生生长因子（PDGF）介导的磷脂酰肌醇3－激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路的激活，发挥对缺血性脑损伤的神经保护作用，还可能通过调节丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径，尤其是ERK1/2途径和氨基酸激酶（JNK）途径，发挥显著抑制大鼠创伤性颅脑损伤引起的神经功能损伤的作用［21-22］。黄芩素会抑制PI3K/Akt通路中p－PI3K、p－Akt、Caspase－3蛋白的表达，减轻细胞凋亡及氧化反应，缓解Aβ对PC12细胞的损伤［23］。这表明红花成分可以通过PI3K/Akt与MAPK途径对阿尔茨海默病通路进行调节，另外这也提示了红花成分对AD的调节可能具有双向性，猜测红花成分的剂量变化可能产生毒性作用，因此在制备红花提取物时应调整好剂量。

分子对接的结果显示，木脂素与APP、MAPK、AKT等有较好的结合活性。研究发现，木脂素不仅能促进Bcl－2并抑制Bax的表达，促进p－Akt活性，还对APP代谢具有一定的调节作用，发挥神经损伤的保护作用［24-25］。另外，厚朴酚（新型木脂素）也可以通过调节磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶－3（PI3K/Akt/GSK-3）途径抑制神经炎症，减轻Aβ沉积，发挥改善认知缺陷的效果［26］。这提示了分子对接的准确性。另外，分子对接中的其他成分Kinobeon A与Pyrethrin Ⅱ，前者显示出了优越的抗氧化性，且清除超氧阴离子的能力大于天然抗氧化剂木脂素或槲皮素［27］，提示Kinobeon A有治疗氧化应激损伤引起的疾病的潜力。而后者属于除虫菊酯的一种，研究认为拟除虫菊酯可使机体产生大量ROS，通过影响脑内抗氧化物水平对脑组织造成氧化应激损伤，但由于对Pyrethrin Ⅱ本身的研究甚少，因此其是否能作为治疗AD的成分还有待考察［28］。

综上所述，笔者发现红花活血化瘀、改善微循环的作用，与发挥抗炎、抗氧化的生物活性密切相关。猜测其改善AD的机制为通过调节APP、CASP3、TNF等靶点，降低神经炎症水平，减缓脑损伤细胞凋亡，同时抑制自由基的产生，下调氧化应激水平，并调控Akt与MAPK等途径，发挥改善由血液循环障碍引起的脑细胞损伤的作用，减轻Aβ沉积，从而延缓AD的发生。另外，研究显示拟除虫菊酯会对脑组织起到负面影响，因此分子对接中的成分Pyrethrin Ⅱ还有待在未来做出进一步的研究。