固相萃取-气相色谱法测定茶叶中甲氰菊酯含量的不确定度评定

曾永明 黄小芮 栾洁 蒙芳慧 周静萱 陈松武

（广西壮族自治区林业科学研究院 广西南宁 530002）

中国是茶叶的故乡，茶礼有缘，古已有之。种茶历史悠久，敬茶礼节严格，饮茶风俗奇特，饮茶至今已有4 700多年历史。中国是种植茶叶国家之一，特别在中国南方地区均广泛种植茶叶。在优良的茶叶生产种植过程中，需要对品种、自然环境条件、管理方式以及加工技术等严格管理：一是保护好茶叶的种植环境，降低污染源的产生；二是通过种豆科类绿肥、铺盖稻草等绿色农艺措施提升地力来减少农药的使用量，降低农残和重金属污染；三是做好病虫害综合防治工作，以虫制虫，促进茶园生态良性循环。但是目前，我国大部分茶园还处于粗放经营阶段，经营管理工作尚不够完善。此外，部分地区因大量施用农药，环境受到严重污染，环境中的农药通过食物链传递并富集，进入人体，长期食用农残超标的农产品将危害人体健康。在茶区调研中，茶农纷纷反映，在喷施农药时，好坏不分，往往把益虫一起杀死，而且效果也不够理想。最令人担忧的是，精制出的成品茶中，存在不同程度的农药残留，这一点应引起高度重视，政府监管部门应该加强监督管理，真正实现食品生产过程中从“农田到餐桌”的全程监管。因此，市场监督和监测成了控制产品质量的最后一道关口，也是保障人民身体健康最重要的一道防线。茶产业的农残污染问题是食品安全的关键因素，对于整个产业的稳定发展起着重要的作用。

甲氰菊酯(Fenpropathrin)，是20世纪七八十年代迅速发展起来的拟除虫菊酯类杀虫杀螨剂，化学名称为α-氰基-3-苯氧基苄基-2,2,3,3-四甲基环丙烷酸酯，分子式为C22H23NO3，在世界各国广泛使用。C22H23NO毒性中等，有触杀、胃毒和一定的驱避作用，属神经毒剂，使昆虫因神经系统过度兴奋、麻痹而死亡，无内吸和熏蒸活性。甲氰菊酯具作用迅速、杀虫谱广、击倒作用强、持效期长、高效、快速、长残效等特性，其最大特点是对多种害虫和叶螨同时具有良好的防治效果，特别适合用于预防茶树害虫茶尺蠖、茶毛虫和茶小绿叶蝉[1]。但在实际生产过程中，部分相关人员存在超量使用农药的现象，致使食品中农药残留，可能对人体健康造成潜在的不良影响[2-3]。在食品安全监测工作中，准确地测量农产品中甲氰菊酯含量，对维护食品安全具有重要意义。目前需要依靠第三方检测机构准确的测量结果来帮助维护食品安全工作，而测量过程中人为操作因素、环境因素、标准物质和仪器设备等方面都会对结果的不确定度造成影响[4-5]。为了提高测量结果的可靠性，找出影响测量结果的最主要因素，本研究参照JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》[6]，采用固相萃取-气相色谱法测定茶叶中甲氰菊酯的含量，通过评定不确定度的方式，对测量过程中可能造成误差的操作进行测算，确定影响测量结果的主要因素，以改进农残测量的精准性，对保障茶叶质量安全具有一定作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器设备MS3 basis旋涡混合器（IKA仪器有限公司）；离心机TD5A-WS（湘仪离心机仪器有限公司）；M32自动高通量平行浓缩仪（北京莱伯泰科仪器股份有限公司）；VM24固相萃取装置（天津博纳艾杰尔仪器有限公司）；GC-2010Plus气相色谱仪（日本岛津公司）；配备电子捕获ECD检测器，色谱柱：SH-Rtx-1（30 m×0.25 mm× 0.25 μm毛细色谱柱)。

1.1.2 测量仪器电子天平，最大允许误差为±0.5 mg；瓶口分液器，最大允许误差为0.03%；10 mL移液管，精度0.02 mL；0.1~1.0 mL移液枪，误差范围为±1%；20~200 μL移液枪，误差范围为±1%；10.00 mL容量瓶，精度0.10mL；ECD检测器的定量允差1.2%等。

1.1.3 标准物质甲氰菊酯，购于农业农村部环境保护科学监测研究所，浓度为100 μg/mL，不确定度U=±3%（k=2）。

1.1.4 化学试剂乙腈（色谱纯，上海安谱公司）；正己烷（色谱纯，上海安谱公司）；丙酮（色谱纯，上海安谱公司）；氯化钠（分析纯，西陇科学股份有限公司）；无水硫酸钠（分析纯，西陇科学股份有限公司）；二级水（自制）。

1.1.5 耗材FLORISIL SPE小柱(1 g，6 mL)（上海安谱公司）；13 mm×0.2 μm有机滤膜（上海安谱公司）。

1.1.6 测定样品茶叶，来自广西壮族自治区市场管理局组织的能力验证机构。

1.2 方法

1.2.1 标准工作溶液的配置从冰箱取出浓度为100 μg/mL的甲氰菊酯标准溶液放在室温为25℃的实验室回温4 h后；用20~200 μL移液枪移取100 μL甲氰菊酯标准溶液于10.00 mL容量瓶中，用正己烷稀释定容至刻度，配制成浓度为1 μg/mL的工作标准溶液（此工作标准溶液保存在4℃冰箱中，有效期一周）。检测时通过稀释在室温为25℃的实验室回温4 h的工作标准溶液，得到0.10、030、0.50、0.70、1.00 μg/mL共5个梯度浓度的标准溶液；采用GC-2010Plus气相色谱仪进行甲氰菊酯含量测定，每一浓度的标准溶液分别进样3次，得到相应的色谱峰面积，用最小二乘法拟合得到标准曲线回归方程。

1.2.2 供试品溶液的制备实验样品为已粉碎的茶叶样品，由广西壮族自治区市场管理局组织的能力验证机构加入甲氰菊酯农药。准确称取茶叶样品和空白样品各2.00 g（精确到0.01 g）于50 mL离心管中，加入18 mL蒸馏水涡旋1 min复原至茶叶鲜样状态，静止30 min使茶叶充分浸润；然后加入20 mL的乙腈和3~5 g氯化钠，用涡旋混合器涡旋2 min，采用TD5A-WS离心机4 000 r/min离心5 min；用10 mL移液管吸取10 mL上层乙腈溶液到15 mL离心管中，调节M32自动高通量平行浓缩仪水浴温度不大于40℃，以氮气流量6 psi吹至近干；加入2 mL正己烷，涡旋1 min，盖上盖子，待净化[7]。

1.2.3 提取液的净化和定容首先向FLORISIL SPE小柱（1 g，6 mL）中填充约2 cm厚的无水硫酸钠，放入VM24固相萃取装置中，按表1操作步骤进行固相萃取操作：在FLORISIL SPE固相萃取小柱中，首先加入5.00 mL正己烷＋丙酮混合液，以1.0 mL/min流速润洗FLORISIL SPE小柱进行活化；接着加入5.00 mL正己烷；以1.0 mL/min流速平衡SPE小柱；然后以1.5 mL/min 流速把待净化样品提取溶液上样于SEP小柱中进行净化；最后洗脱，调节流速为1.5 mL/min，依次用2.5 mL正己烷+丙酮（9∶1）进行洗脱，用15 mL离心管收集洗脱液约8~9 mL。在M32自动高通量平行浓缩仪上控制水浴温度不高于40℃，调节氮气流量为6 psi，将收集的洗脱液氮吹浓缩至近干；用移液枪正确加入1 mL正己烷，在涡旋混合器涡旋1 min，过0.2 μm有机滤膜，装瓶上机测定。

表1 提取液净化和定容操作步骤

1.2.4 气相色谱条件毛细管色谱柱：SH-Rtx-1（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；初始温度180℃保持8 min，以15℃/min速度升至220℃，保持1 min，再以30℃/min升至250℃，保持10 min；进样体积：1 μL；进样口温度：250℃；分流比1∶50；ECD检测器温度：280℃；氮气流速：30 mL/min；柱流速：2 mL/min。

2 结果与分析

2.1 数学模型的建立

分别称取10组试样，进行平行试验，用外标法定性和定量，试样中农药残留量计算公式如下：

式（1）中：ω，试样中农药残留量，mg/kg；ρ，标准溶液中农药的质量浓度，mg/L；A，样品溶液中被测农药的峰面积；As，农药标准溶液中被测农药的峰面积；V1，提取溶剂总体积，mL；V2，用于检测的提取溶液的体积，mL；V3，样品溶液定容体积，mL；m，试样的质量，g。

2.2 测定不确定度分量来源分析

根据测量过程和公式（1），茶叶中甲氰菊酯含量测定不确定度的来源如下：

（1）配制标准溶液时引入的不确定度U1,rel，包括标准物质纯度引入的不确定度U1，标准工作溶液稀释过程中移液器引入的不确定度U2，容量瓶容量引入的不确定度U3，定容时人为读数误差引入的不确定度U4，定容时温度变化引入的不确定度U5[8-10]；

（2）标准曲线引入的不确定度U2,rel[11]；

（3）称样时电子天平引入的不确定度U3，rel；

（4）添加萃取溶剂时瓶口分液器引入的不确定度U4,rel；

（5）移取萃取溶液时10 mL刻度吸管引入的不确定度U5,rel；

（6）固相萃取过程中引入的不确定度U6,rel；

（7）样品定容时1 mL移液枪引入的不确定度U7,rel；

（8）气相色谱仪自动进样引入的不确定度U8,rel；

（9）ECD检测器响应值引入的不确定度U9,rel；

（10）重复测量的相对不确定度U10,rel（A类）。

试验所用试剂均为色谱纯，因而空白样品测定所致的不确定度影响很小，可忽略不计。

2.3 各不确定度的评定

2.3.1 配制标准溶液时引入的不确定度U1,rel

2.3.1.1标准物质纯度引入的不确定度U1[12]根据标准物质证书，甲氰菊酯标准物质的浓度为100 μg/mL，不确定度为0.12 μg/mL，按矩形分布计算，k= 3，则：

2.3.1.2标准工作液稀释过程中移液枪引入的不确定度U2用移液枪移取100 μL甲氰菊酯标准品溶液于10 mL容量瓶中，用正己烷定容，配成标准工作液。移液枪说明书给出误差范围为±1%，按矩形分布计算则：

2.3.1.3标准溶液定容过程中容量瓶引入的不确定度U3A级单标线10 mL容量瓶最大误差为±0.10 mL，按矩形分布计算，k＝ 3，则：

2.3.1.4定容时读数误差引入的相对不确定度U4定容时人为读数误差引入的不确定度可根据重复读取实验数据进行计算，表2为10 mL容量瓶重复6次定容实验结果，根据表2中的数据计算得：

表2 10 mL容量瓶重复定容实验结果 单位：mL

2.3.1.5定容时温度引起体积变化引入的不确定度U5试验在25℃条件下进行，而容量瓶是在20℃校准的，正己烷体积膨胀系数为1.36×10–3℃–1，容量瓶和溶液温度与校准时不同所引起的体积变化为：±100 mL×5℃×1.36×10–3℃–1=0.68 mL，按矩形分布计算，则：

拟合以上5项得出配制标准溶液时引入的不确定度为：

2.3.2 标准曲线引入的不确定度U2,rel实验经过初筛，确定配置5个梯度浓度的甲氰菊酯标准溶液，其浓度分别为0.10、0.30、0.50 、0.70、1.00 μg/mL，采用GC-2010Plus气相色谱仪进行甲氰菊酯含量测定，每一浓度的标准溶液分别进样3次，得到相应的色谱峰面积[5]（n=15，详见表3）。

表3 标准系列溶液色谱峰面积测量结果

用最小二乘法拟合得到线性回归方程为Y=173 694x+637.352，R2=0.999[13-14]。同时对茶叶样品溶液中甲氰菊酯的浓度重复测定3次，由线性回归方程计算得样品溶液的质量浓度分别为0.60、0.59、0.61 mg/kg，平均值为0.60 mg/kg，则用标准曲线求得样品溶液浓度引入的相对不确定度按式（8）计算：

式中：S，标准校正曲线残差的标准偏差；对样品中甲氰菊酯浓度进行3次测定，由线性回归方程求得样品的平均质量浓度，0.60 mg/L；a，线性回归方程的斜率；N，样品平行测定次数，N=3。将相关数据代入式（3），得：U2,rel=0.024。

2.3.3 样品称量时天平引入的相对不确定度U3,rel根据电子天平的检定证书，其最大允许误差为±0.5 mg。实验中称取m=2 g（2 000 mg）样品，按矩形分布计算，则称重标准不确定度为：

2.3.4 添加萃取溶剂时瓶口分液器引入的不确定度U4,rel根据瓶口分液器说明书，移取20 mL乙腈萃取溶剂，其最大允许误差为0.03%×20 mL=0.006 mL，按均匀分布计算，k= 3，则：

2.3.5 移取萃取溶液时10 mL刻度吸管引入的不确定度U5,rel

2.3.5.1移液管体积刻度的不确定度依据JJG 196—2006《常用玻璃量器》，10 mL刻度吸管(A级)容量允差为±0.050 mL，按均匀分布，标准不确定度为：0.050/3＝0.029 mL[15]。

2.3.5.2液体充满至移液管刻度线的估读误差依据JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》，移液管刻度线误差经验值为0.02 mL，按均匀分布，标准不确定度为：0.02/3=0.012 mL[16]。

2.3.5.3温度变化引入体积变化的标准不确定度实验在25℃条件下进行，水的膨胀系数为2.1×10–4/℃-1，按均匀分布，温度变化引起的标准不确定度为：

合成以上3项得出10 mL分刻度吸管不确定度为：

2.3.6 固相萃取过程中引入的不确定度U6,rel固相萃取过程需要经过SPE的活化/平衡、上样、洗脱、浓缩、定容等步骤，很难确定每一步骤对测量结果不确定度的贡献，实验中一般采用方法的回收率对固相萃取过程引入的不确定度进行评定[13]。取7份茶叶样品，其中1份作为空白，其它6份分别加入0. 60 μg/mL标准溶液，经同样品测定进行平行试验。精密度和回收率结果如表4所示，回收率的标准差：

表4 回收率测定结果

2.3.7 样品定容时1 mL移液枪引入的不确定度U7,rel样品经氮吹浓缩后定容过程的不确定度主要由1 mL移液枪产生，用移液枪移取1 mL正己烷定容，根据移液枪检定证书给出误差范围为±1%，按矩形分布计算，k= 3，则[17]：

2.3.8 气相色谱仪自动进样引入的不确定度U8,rel进样体积引入的不确定度主要源于自动进样器进样针体积重现性。根据本气相色谱仪自动进样器技术参数（进样体积为1 µL，进样重现性不大于0.5%），按矩形分布计算（B类评定，k[18]，则：

2.3.9ECD检测器响应值引入的不确定度U9,rel气相色谱仪灵敏度较高，故仪器稳定性及测定值分散性是ECD检测器测量不确定度的主要来源。采用标准工作溶液连续测定8次，测得质量浓度数据见表5，以质量浓度值的分散性计算相对不确定度：

表5 标准工作溶液重复测定实验结果

2.3.10 重复测量的相对不确定度U10,rel（A类）测量茶叶样品中甲氰菊酯质量浓度，共进行了10次平行试验，结果见表6。

表6 平行试验结果值

3 不确定度的合成与扩展

3.1 合成相对标准不确定度

标准不确定度分量来源、量值、贡献率见下表7。

表7 标准不确定度分量汇总

利用U1,rel~U10,rel不确定度分量结算结果计算合成相对不确定度[19-20]，得：

实验测得茶叶样品中甲氰菊酯质量浓度为0.60 mg/kg，合成标准不确定度为：Uc(rel)=Urel×x=0.034×0.60 mg/kg=0.020 mg/kg

由表7可知，测量茶叶中甲氰菊酯含量过程中，不确定度的来源影响大小为标准工作曲线＞重复测量＞固相萃取过程＞ECD检测器＞标准溶液配置＞10 mL分刻度吸管＞自动进样器＞瓶口分液器＞样品称量＞1 mL移液枪；其中标准工作曲线、重复测量、固相萃取过程、ECD检测器和标准溶液配置引入的不确定度较大，贡献率达35.74%、31.27%、14.29%、6.85和6.25%。

3.2 扩展不确定度

取95%的置信概率，包含因子k=2，则扩展不确定度U(x)=k×Uc(rel)=0.040 mg/kg。因此，采用固相萃取-气相色谱法测定茶叶中甲氰菊酯浓度，当测量的数据为0.60 mg/kg时，测量的结果表示为（0.60±0.040）mg/kg，k=2。

4 讨论与结论

4.1 标准物质的使用

检验用的标准物质或标准溶液的准确性直接影响到定量结果的准确性和可靠性。标准物质的溯源性至关重要，实验应使用有证的标准物质。本试验为农药残留的能力验证活动，对于标准溶液的要求相对来说比较高，具体有以下几个方面：一是农残标液应该购买新生产的，因为农药具有不稳定性，在光、热影响下容易发生分解及转化；二是农残标液应在符合标液证书的保存条件下进行保存；三是农残的标液不确定度相对来说比较大，因此最好采用液标和固体标准物质的配制溶液进行比较，以确保其可靠性；四是配制农残标准溶液时要注意介质的使用，根据母液与农药的溶解性、样品检验标准方法中的提取液及定容上机的溶剂来进行选择。

4.2 样品的保存和前处理

一是农药残留量本身比较低，而且农药具有不稳定的特性，因此实验室在接到样品后应立即进行实验，无法马上进行实验的应将样品处于（0~4）℃冷藏箱中避光保存；二是由于样品是经过冷藏的，在进行实验之前最好将样品放置至室温后再进行称样，否则易吸收空气中的水分造成称量误差；三是样品的前处理要根据检验方法选择合适的有机溶剂，提取方式、时间应按照检验方法的要求严格进行，否则会出现提取不完全的情况；四是由于茶叶样品中的成分比较复杂，样品中的色素及脂类成分都可能影响实验结果，所以最好对提取液进行有效的净化处理，而且要进行多次洗脱，使目标组分全部转移到提取溶液中，避免组分的损失。

4.3 仪器设备

一是农残分析对于仪器的要求比较高，实验前应该对仪器的进样针、气路、色谱柱、检测器等进行清洗及净化，使样品分析过程中不受污染；二是分析检测时要确保分析仪器处于稳定状态，参数设置及分析条件优化到最佳状态，实验室应根据所用仪器型号将仪器调整至最佳状态；三是为了避免系统误差，条件允许的情况下，可以用多台仪器进行结果比较，而且要注意进样过程中试剂的挥发对结果造成的影响。

4.4 检验人员

一是检验人员在实验前应熟悉检验方法标准，掌握检测方法基本原理，实验过程要求做到操作规范、熟练，严格按检测方法的要求对样品中的目标组分进行检测；二是检验人员应熟知保证结果准确性的验证方法，比如通过进行加标实验，将加标实际结果与理论结果相比较，如果出现回收率过高或过低的情况应及时进行原因分析并纠正；三是检测人员应考虑农残的检测中各种因素的影响，比如样品中的基质效应对农残结果影响很大，因此应该通过基质曲线加标的方式将这个影响降低到最小。

因此，用固相萃取-气相色谱法测定茶叶甲氰菊酯的过程中，应选用有证的标准物质，精度较好的量器，规范移液管和容量瓶的操作，确保配置标准工作溶液浓度的准确性；选择拟合线性高的工作曲线进行校准；规范样品的保存和前处理步骤；对分析仪器进行日常维护和按时检定；加强检验人员的检测技术培训，适当增加平行样来降低不确定度，提高检测结果的准确性。

本试验采用固相萃取–气相色谱法测定茶叶中甲氰菊酯浓度，测量不确定度主要来源于甲氰菊酯标准工作曲线、重复测量、固相萃取过程、ECD检测器和标准溶液配置，贡献率分别为35.74%、31.27%、14.29%、6.85和6.25%，其中标准曲线引入的不确定对测量结果的影响最大。