化学交换饱和转移对比剂的分类及其价值

胡飞翔 综述 彭卫军， 童彤 审校

常规磁共振扫描对于显示病灶与正常组织的对比度差异仍存在不足，此时则需要额外引入对比剂来增加对比度从而突出病灶显示。临床上常见的顺磁性T1成像对比剂主要包括钆基络合物(如Gd-DTPA和Gd-DOTA)及锰福地匹三钠[manganese(II) dipyridoxyl diphosphate,Mn-DPDP]等，该类对比剂可以明显缩短氢质子在外加磁场下的纵向弛豫时间，使得T1信号增强，呈高亮信号，从而提高病变检出的灵敏度，但其特异性并不高，并且窗口期较短，往往需要高剂量注射，具有循环时间短、分布不明确及价格昂贵等缺点。受检部位的血流量大小对该类离子型对比剂的分布影响明显，肿瘤由于新生血管网丰富伴血管畸变明显，使得对比剂形成聚集分布趋势，从而达到信号增强的目的。但是这种信号增强效果不仅出现在肿瘤部位，由炎症或外伤所导致的充血水肿部位也会出现对比剂聚集现象，表现为异常强化的高信号，增加了肿瘤性病变的鉴别难度[1]。此外，铁磁性和超顺磁性物质类的T2对比剂其理论基础是降低成像信号从而改变对比差异，可以表现为影像图像上成像部位的亮度减低，引起分辨率和对比度降低，不利于准确识别病灶区域的范围及微小病灶，从而增加诊断难度，造成不必要的漏诊与误诊。

使用对比剂时，往往希望可以在尽可能低的浓度下获得较高的增强图像质量，从而避免引起生理环境紊乱并将毒性降至最低。但MRI检查通常需要高浓度的对比剂来提高对比度，更糟糕的是，大多数用于增强弛豫的(超)顺磁性金属在不螯合或无涂覆时都是具有毒性的，极大地限制了其应用。因此，CEST方法作为一种新型成像技术应运而生，并逐步向临床实践转化，这种技术为肿瘤代谢和酸中毒的体内成像提供了较高的空间分辨率和灵敏度。检测身体组织中除水以外的分子同样具有重要意义，其能够探索与体内生理功能和病理状况相关的化合物和代谢物。CEST成像具有为肿瘤组织诊断和评估治疗反应提供分子可视化信息的潜能[2,3]。本文系统性回顾了目前常见的CEST对比剂类型，并阐述其理论机制，以期为今后新型对比剂的开发提供理论依据。

CEST对比剂的成像机制

CEST成像综合了磁共振波谱成像(magnetic resonance spectroscopy,MRS)和MRI的优点，其中能够影响到MRS的化学交换主要包括两种方式,即分子内交换(如核酸的螺旋-螺旋跃迁或蛋白质的折叠/展开过程)和分子间交换(如质子化/去质子化过程或小分子和大分子的结合);其中分子间交换与CEST对比剂息息相关，因为其包括溶质分子(外源性或内源性可交换质子)与主体溶剂(体内自由水质子)间的化学交换，从而影响图像信号源并相互作用，提高图像对比度。考虑到MRI在临床上主要是一种水成像技术，对于CEST成像，我们主要关注溶质与水质子间的交换。

尽管CEST是fMRI一个相对较新的研究领域，但它的起源可以追溯到早期MRS，其对特定的可交换质子池进行成像的过程是分子成像的理论基础，并且具有诸多优点。首先，由于在饱和脉冲期间发生多次质子交换，来自一小部分溶质质子(μM～mM)的信号被放大并转移到更大的水信号上(纯水约110 M)，从而可以极大地提高检测灵敏度。其次，使用频率选择性饱和脉冲来照射溶质质子可随意“打开或关闭”对比增强模式，并通过它们相对于水的化学位移来识别这些质子。CEST成像同时结合了MRS和MRI的优点，用于间接检测代谢物、血管灌注和酶活性等分子功能，并为定量肿瘤微环境pHe变化提供了理论依据。CEST允许检测具有与水进行化学交换可移动质子的分子，以特定偏移量施加射频(RF)脉冲，对应于移动质子的吸收峰，使移动质子的磁化无效，从而变得“饱和”。饱和质子与水分子的交换导致磁化强度降低，因此水信号降低，产生可被MRI检测到的(负)对比增强。 因此，由于可交换的移动质子的存在，许多内源性(蛋白质、肽、糖)或外源性分子可以通过CEST进行成像[4-7]。CEST成像实际上克服了MRS的一些浓度限制，通过连续的再循环过程和饱和交换的方式极大地提高了检测灵敏度。

CEST对比剂的分类

常规磁共振对比增强需引入外源性对比剂来产生缩短驰豫时间的效应，从而引起图像明暗改变，需要进行注射前后扫描，不仅增加了检查时间和患者经济负担，而且难以避免对比剂所产生的副作用。新型的利用化学交换饱和转移机制产生的对比剂依赖于选择性射频脉冲来“打开”增强效应，而在非共振频率下的射频脉冲不会引起对比度变化[8]。目前，CEST对比剂主要分为以下几大类：①具有可交换-NH2/-OH基团的抗磁性Dia-CEST对比剂；②螯合有顺磁性金属的Para-CEST对比剂；③脂质体包裹的顺磁性金属和可交换水的Lipo-CEST对比剂；④基于19F核的离子Ion-CEST对比剂；⑤以超极化气体Xe作为分子探针的Hyper-CEST对比剂[9-13]。

Dia-CEST

抗磁性Dia-CEST对比剂通常是不含金属离子的天然分子物质，其信号强度取决于不稳定质子的数量和类型。首批CEST对比剂是含有可交换的-NH和-OH质子的抗磁性Dia-CEST对比剂，由Ward等[14]于2000年首次报道，Dia-CEST对比剂相较于其他类型的对比剂具有显著优势是因为其本属于内源性对比剂，在生物体内广泛存在，并可通过生物体内的多肽、多糖及蛋白质中获取，因此可应用于活体研究，并且对生物体完全无害及无毒副作用。糖的许多-OH质子在水中的低场共振频率约1 ppm，肌酸和精氨酸的-NH2质子共振频率约2 ppm，肽的酰胺质子共振频率约3.5 ppm[15]。Ward等[16]首次提出Dia-CEST对比剂当超过一种可交换质子位点时，可通过“比率方式”来定量pH变化，这种测量方式可有效避免对比剂浓度对成像对比增强的影响。目前，常用于CEST效应的移动质子是羟基 (-OH)、酰胺 (-NH) 和胺 (-NH2) 基团中的氢质子，它们存在于内源性分子或专门设计的添加到组织中的外源性化合物。许多天然代谢物、大分子和人工合成的不含金属离子化合物等，都具有可交换的质子，使得它们可被用作生物相容性和可生物降解的CEST对比剂。

Para-CEST

顺磁性化学交换饱和转移(Para-CEST)对比剂是基于伪接触位移(Pseudo contact shifts,PCS)原理，顺磁性金属离子可以与配位的水质子或螯合物中可交换质子发生伪接触作用实现化学位移，利用后者与水质子间发生化学交换的方法，实现CEST成像[17]。许多过渡金属离子都具有磁性，在特定饱和频率脉冲下可实现较大的偏移，从而有利于和自由水所在的频率显著区分开来，Para-CEST对比剂主要是由顺磁性金属离子复合物组成，如FeII、CoII、NdIII、PrIII、EuIII、TbIII、DyIII、TmIII和YbIII等[10,18]；而镧系元素可以在50 ppm处产生明显的化学位移，此时的交换速率要小于其化学位移，从而可以获得明显信号放大作用，这些特性适用于作为Para-CEST对比剂使用[19]。Bond等[20]发现CoII可用于Para-CEST对比剂来响应pH值的变化，[Co(1,8-CCRM)]2+复合物是热力学研究最为青睐的异构体之一，其与[Co(1,4-CCRM)]2+复合物相比，具有易于分离和金属转移的优势，同时能产生两个明显的CEST峰，该峰由两组重叠的NH酰胺峰组成。二价过渡金属离子配合物具有广泛的应用前景，与镧系离子不同，这些过渡金属离子具有丰富的配位化学性质，以及合成多样新型配体的机会。Para-CEST对比剂亦可通过比率的方法定量pH值变化，如YbHPDO3A在结构上存在同分异构体，通过羟基位置的异构可实现66.2 ppm和91.6 ppm处的CEST效应，通过两处CEST峰计算羟基与水质子的交换速率，可以实现pH的线性拟合，准确识别5.2～6.7范围内的pH值变化[21]。Ratnakar等[22]报道了一种pH敏感型的Para-CEST对比剂，该对比剂缺乏内层水分子，但包含了一个用于CEST信号激活的镧系离子结合的-OH基团，可以频率选择性响应pH改变。Yb3+复合物显示出单一、高度偏移的CEST峰，源于可交换的Yb-OH质子，其频率变化在生物学相关的pH范围内，可以响应6～8之间的pH值变化。Para-CEST对比剂通过金属离子与水分子和可交换-NH位点进行缓慢质子交换，可以实现多位点“比率”的方式测量pH改变，从而避免浓度的影响。

Lipo-CEST

脂质体化学交换饱和转移(Lipo-CEST)对比剂的检测限可以控制在皮摩尔范围内[23]，在微量溶质的检测方面具有广泛应用前景。Lipo-CEST对比剂检测是基于脂质体内水信号与射频(RF)脉冲间的选择性饱和机制，脂质体膜上的水交换导致大量的水信号被部分饱和，从而引起MR图像中的负对比增加。Terreno等[24]首次研究出Lipo-CEST对比剂，该团队将顺磁性金属离子包裹在脂质体内，而脂质体内外具有大量水分子分布，顺磁性金属离子螯合物通过改变内部水分子的化学位移，从而实现内外水分子的质子交换，可以明显放大CEST效应。有研究提出在MR引导下实现药物递送的新概念[25]，新型的温度敏感型脂质体对比剂可以利用1H-CEST对比剂作为药物载体进行定位，同时使用19F-CEST对局部温度升高作出反应，并观察和量化药物释放的过程。这种新型的温度敏感型对比剂，在MR图像引导下使用聚焦超声可以显著改善脂质体药物载体的局部治疗功效。Terreno等[26]制备出一种新型的双模态1H T1-CEST脂质体对比剂，该探针具有在T1加权图像中被检测到的特性，只要触发刺激Gd(III)-复合物从囊泡中裂解，则可以使T1对比增强关闭并开启CEST效应，从而以这种方式响应触发因素。另外，控制脂质体的大小不仅可以影响Lipo-CEST对比度，还可以影响体内的生物分布和药物摄取，而肿瘤的最大累积效应也取决于脂质体的大小和组成。Zhao等[27]发现选择小于100 nm的脂质体，可以最大限度地提高Lipo-CEST对比度，并可能适用于体内的肿瘤成像和治疗。在理想情况下，小于100 nm的脂质体会产生更强的对比度；然而，这些小型脂质体会很快被肝细胞清除，从而减少了它们在血液中的循环周期。通过在脂质体表面涂上聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)，可显著降低肝脏和脾脏对脂质体的清除率，并可以通过新生血管的渗透作用在肿瘤组织中聚集。Lipo-CEST对比剂设计之初是通过极大程度地增加可交换质子浓度来进一步提高检测灵敏度，当脂质在水中自发组装形成脂质体时，使得脂质的疏水部分聚集在一起并形成磷脂双层封闭球形结构，该封闭结构将水分子分为脂质体内外两部分，当内部水分子发生化学移位时，其不仅可以在内部发生快速交换，还可以与脂质体外部水分子进行交换，经交换后的脂质体内部水的CEST效应得以明显放大。

Ion-CEST

离子型化学交换饱和转移(Ion-CEST)对比剂可追溯到2013年，由Bar-Shir等[28]首次发现离子含量可以通过含19F核的CEST效应实现检测，其理论基础是金属离子的去存机制，金属离子可以通过结合和分离的方式来改变螯合物上19F的化学位移，在双池模型中，螯合物本身的19F可以看作为大池，而与金属离子结合的螯合物上19F视为小池，从而发生类似于化学交换过程，实现金属离子的检测。其中，大池中的19F含量要明显低于水质子，通过降低大池中的自旋核密度，突破小池检测限制，实现微摩尔级别的信号放大，并减少背景信号的影响。不足的是，随着自旋核密度在大池中减低，相应的成像信噪比也会降低。Peng等[29]开发出一种可检测金属离子的Ion-CEST探针，为Ca2+离子及其他金属离子定量提供了新的检测思路。Srivastava等[30]合成的FeII-DOTAm-F12复合物探针具有19F和CEST双模式对比剂的特性，其CEST响应的大小取决于探针的浓度和pH值，在pH值为6.9～7.4之间时，化学饱和转移明显增加，pH范围恰好与肿瘤酸性微环境相关。此外，探针19F信号的信噪比只取决于其浓度而与pH值无关，因此该复合物探针可以通过比率的方式准确定量pH值改变，并区分pH值在6.9～7.4之间的细微变化。最近，Shusterman-Krush等[31]使用19F-MRI中的CEST原理获得了一种可以将信号放大900倍的生物相容性氟化剂，并可以通过“多颜色”的方式呈现。利用一种称为客体交换饱和转移(Guest Exchange Saturation Transfer,GEST)的方法，通过主-客体超分子集合的动态交互作用，他们发现一种可吸入的氟化麻醉剂可以作为一种单一的19F探针同时可检测出两个靶点的微摩尔水平的变化。另外，多模态的1H/19F磁共振CEST成像可以对Graves眼病的几个标志物进行综合分析，并能够评估眼眶免疫细胞浸润、水肿改变、细胞外基质的变化，同时可以对脂肪和肌肉尺寸进行量化[32]。众所周知，金属离子参与了无数的生物活动过程，而无创的含量检测依然具有挑战性。

Hyper-CEST

超极化化学交换饱和转移(Hyper-CEST)对比剂是利用超极化129Xe来实现CEST效应的一种非氢质子成像手段。通过自旋交换光泵(Spin Exchange Optical Pumping,SEOP)的方法对惰性气体129Xe进行超极化处理，并成功将信号放大至10000倍以上[33,34]。基于129Xe易被极化的特性，当其与主体分子发生结合与分离时，该过程是可逆的交换过程。当发生结合时，会造成化学位移并明显偏离于溶解态的129Xe，最终通过化学交换的方式完成与主体分子结合129Xe的饱和作用，通过CEST信号的检测实现主体分子的探测。Schröeder等[35]于2006年首次提出Hyper-CEST方法，该团队利用129Xe与主体(穴番)分子相结合，实现CEST成像。Zhang等[36]开发出一种新型氟化纳米乳剂，可以显著放大体外和体内的129Xe-CEST、19F-MRI及荧光信号，可用于检测和增加肿瘤诊断的敏感性以及提高肿瘤的光动力学治疗效果。气泡纳米颗粒(Gas vesicle nanoparticles,GVs)是在细菌和古细菌中表达的含气体的蛋白质组装物。Mizushima等[37]在人类癌细胞中建立了具有与天然气体囊泡纳米颗粒(GVs)相似的双酮结构特征的蛋白质纳米颗粒并稳定表达，同时还证明了它们的大小和形状的遗传调节性。此外，GVs被证明作为可多路重复使用、具有敏感性和基因可编码性的对比剂应用于Hyper-CEST成像的实用性，并用于体外的人类细胞研究。Klass等[38]报道了一种基于轮烷的129Xe超极化CEST核磁共振对比剂的合成和特性，该对比剂可以响应过氧化氢，而过氧化氢含量在多种病理状态下会发生上调，采用129Xe超极化CEST谱可检测出低微摩尔范围内添加的过氧化氢。Hyper-CEST可以选择性地检测出内源性产生的微量过氧化氢含量，通过分析病变组织异常升高的过氧化氢水平，能够为肿瘤微环境评估及成像应用提供重要的研究基础。

CEST成像的不足

虽然CEST成像可以显著放大溶质分子的信号并明显提高诊断灵敏度，但目前的CEST成像仍然面临着一些重要挑战，其中最主要的问题是如何通过CEST谱来定量分析溶质的质子浓度，溶质的质子浓度检测受多方面条件制约，同时化学交换的速率受温度变化和pH等因素影响。因此，很难通过CEST谱上水信号的衰减量来定量溶质的质子浓度。此外，经典的双池模型仅考虑溶质和溶剂两者间的交换，而生物组织体内由于具有很强的磁化转移效应干扰并且存在很多种可交换溶质，它们的CEST信号可能会相互叠加在一起，进而加大了量化分析的难度[39]。在活体内往往含有大量的内源性CEST背景信号，因此很难定量单一的CEST信号，并准确识别相应的溶质含量，所以不仅要从改善主磁场B0与射频场B1的不均匀性出发，还要开发出新型CEST探针来远离内源性背景信号的干扰。目前CEST成像具有脉冲可调制及频率可编码特性，研究中可以调制脉冲信号实现CEST信号的放大与缩小，并采用频率编码的方法对多个可交换位点完成瞬时检测，利用不同位点化学位移和不同频率编码通过比率的方式实现定量分析，从而排除对比剂浓度及离子富集所造成的干扰。

展望

CEST成像技术为发展病理组织可视化和分子水平检测提供了很好的方法，而CEST对比剂必然是决定成像的关键因素，能否开发出新型的对比剂对于疾病诊断及个体化治疗至关重要。CEST效应的发现为新型MRI对比剂的设计和检测增加了一个新的维度，它们作为真正的无创对比剂具有巨大的应用潜力，CEST方法为临床分子成像提供了新的机会。